Deuterovaný chloroform
13.4.4 Hodnocení a udržování výkonnosti přístroje
Začlenění laboratorních přístrojů do systémů řízení kvality používaných pro certifikaci laboratoří (např. ISO17025 pro analytické laboratoře) vyžaduje pravidelné hodnocení a udržování výkonnosti přístroje. Tyto certifikace umožňují laboratorním analytikům vytvářet testy kvalifikace provozu (OQ) a kvalifikace výkonnosti (PQ) kolem zamýšleného použití přístroje. Pro NMR se tedy testy OQ/PQ mohou lišit v závislosti na běžných analytických testech, které se mají na přístroji provádět. Moderní přístroje mají automatické postupy, které vyžadují, aby uživatel vložil příslušný vzorek, a poté se automatizovaně provede řada testů. Na konci těchto testů je vydána zpráva, která uživateli umožňuje posoudit celkovou výkonnost spektrometru.
Pro testování proteinových terapeutik ve vodných roztocích by tyto testy OQ měly zahrnovat: teplotní kalibraci, tvar čar na signálu acetonu v deuterovaném chloroformu, citlivost na signály ethylbenzenu v deuterovaném chloroformu a/nebo potlačení vody s posouzením citlivosti na anomerní protony 2 mM roztoku sacharózy. Teplotní kalibrace je důležitá, protože dynamika proteinu je ovlivněna podmínkami okolního roztoku, což může mít velký vliv na pozorované šířky čar a frekvence signálu. Regulace teploty vzorku v NMR spektrometrech závisí na pečlivé kontrole teploty a průtoku vzduchu v sondě. Vliv vzduchu sondy na teplotu vzorku lze měřit pomocí měření chemických posunů 100% roztoku methanolu nebo 100% roztoku ethylenglykolu. Tyto posuny byly pečlivě změřeny, aby bylo možné posoudit skutečnou teplotu vzorku při daném nastavení teploty vzduchu sondy a průtoku.
Vliv dobrého stínění vzorku (tj. rovnoměrného magnetického pole v pozorované části vzorku) na kvalitu spektra nelze přeceňovat: čím užší jsou píky, tím lepší je rozlišení a citlivost měřených signálů. Konkrétně, pokud se používají techniky potlačení signálu, čím užší je základna píku, který má být potlačen, tím lépe budou fungovat techniky předsaturace nebo selektivního potlačení signálu v úzkém pásmu. Nástup technik mapování pole a gradientního stínování naštěstí zjednodušil tento často časově náročný úkol úpravy nastavení stínování pro každý vzorek. Budou však existovat vzorky, pro které nebudou stínové mapy dobře fungovat, a bude třeba věnovat čas nastavení stínových map, aby se dosáhlo optimální odezvy přístroje.
Posouzení citlivosti spektrometru pomocí standardních vzorků je ideálním způsobem sledování výkonnosti systému a hodnoty získané ze standardních testů musí splňovat nebo překračovat specifikace spektrometru stanovené výrobcem. Za zmínku stojí, že specifikace spektrometru jsou často výrobcem stanoveny konzervativně, aby bylo zajištěno, že jeho přístroj při instalaci těmito testy projde. Provádění testů OQ/PQ v pravidelných intervalech však umožňuje majiteli spektrometru seznámit se s možnostmi jeho konkrétního přístroje. Odchylky od souboru hodnot stanovených rutinním testováním by měly být pečlivě zkoumány, protože by mohly být známkou nesprávné funkce přístroje.
V případě analýzy malých molekul v organických rozpouštědlech vede použití acetonového signálu v deuterovaném chloroformu k dosažení nejen Lorentzova tvaru čar a úzké FWHH, ale i úzké báze (např. <20 Hz při 20 % signálu 13C-satelitu) obvykle k nejlepší citlivosti na signály ethylbenzenu v deuterovaném chloroformu. U spektrometrů používaných k získávání spekter ve vodných roztocích je důležitější druhé měření citlivosti: schopnost spektrometru získat dobrou citlivost a rozlišení ze signálů v blízkosti píku vody. Proto je měření citlivosti pomocí signálů anomerních protonů ze standardu tvořeného 2 mM sacharosy v 95% roztoku H2O/5% D2O s aplikovaným potlačením vody realističtějším měřítkem výkonnosti spektrometru v poměru signál/šum pro NMR proteinových terapeutických vzorků.
Pro PQ na spektrometru hodnotícím kvalitu proteinových terapeutik je kritickým atributem kvality těchto léčiv specifická terciární struktura daná skládáním řetězce aminokyselin. Proto lze jako PQ na spektrometru provádějícím analýzu 2D strukturních map provést 2D-HSQC spektra v krátkém časovém úseku na vzorku obohaceném izotopicky 15N nebo 13C, aby se zjistila schopnost spektrometru provádět pulzní programy s účinnými schématy odpojování a volbou gradientové koherence. Standardní roztoky 13C nebo 15N izotopicky obohacených proteinů (např. protein s SH3 doménou nebo ubikvitin) v uzavřených zkumavkách jsou komerčně dostupné v koncentracích, které umožňují sběr dat během několika hodin. Vhodně kalibrované spektrometry s frekvencí 500 MHz a vyšší a vybavené kryosondou mohou měřit 2D strukturní mapy u proteinů s přirozeným výskytem (tj. neobohacených izotopicky) při koncentraci ∼1,0 mM za 2-3 dny provozu spektrometru .
.