Diagnostika a detekce C. diff:
Clostridioides difficile je nejčastější příčinou infekčních průjmů ve zdravotnických zařízeních a podle údajů ze systému sledování nových infekcí CDC v roce 2011 způsobil téměř půl milionu infekcí a 29 000 úmrtí do 30 dnů od stanovení diagnózy. Pro diagnostiku infekce Clostridioides difficile (CDI) je k dispozici velké množství testů – detekují nukleovou kyselinu, enzym a/nebo toxiny specifické pro C. difficile v různých kombinacích a algoritmech – a to vedlo ke značným nejasnostem ohledně klinické interpretace a rozlišení mezi kolonizací a skutečnou infekcí.
Infekční společnost Ameriky (IDSA) nedávno zveřejnila aktualizované pokyny pro klinickou praxi týkající se CDI včetně doporučení pro testování. Tato doporučení uvádějí, že preferovanou populací pro testování CDI jsou pacienti s nevysvětlitelným a nově vzniklým průjmem sestávajícím z ≥ 3 neforemných stolic během 24 hodin. Pro instituce, ve kterých neexistují předem dohodnutá institucionální kritéria pro předkládání stolice pacientů, byl nejlépe fungující metodou určenou podle pozitivní a negativní prediktivní hodnoty test na toxiny ve stolici jako součást dvou- nebo třístupňového algoritmu spíše než samotný test amplifikace nukleové kyseliny (NAAT). Uvádějí 2 běžné metody: 1) použití testu glutamátdehydrogenázy plus toxinového testu arbitrovaného testem amplifikace nukleové kyseliny (NAAT) nebo 2) NAAT plus toxinový test. Toto doporučení je však hodnoceno jako „slabé“ s „nízkou kvalitou důkazů“. Panel zdůrazňuje, že ve skutečnosti je nejcitlivější metodou diagnostiky samotný NAAT nebo vícestupňový algoritmus, který by měl být použit v případě, že existují předem dohodnutá institucionální kritéria pro předložení stolice.
Tato doporučení odrážejí přetrvávající nedostatek shody ohledně optimálních strategií diagnostiky CDI. Doporučení se dále liší, pokud vezmeme v úvahu doporučení ze zemí mimo USA: Evropská doporučení upřednostňují detekci toxinů a kladou menší důraz na NAAT nebo vícestupňové algoritmy.
Diagnostické strategie a omezení
Detekce toxinů a kultivace: Historicky je zlatým laboratorním standardem toxigenní kultivace, kdy se C. difficile kultivuje ze stolice a izoláty se testují na schopnost produkovat toxin; filtráty stolice lze také přímo testovat na toxin pomocí testu buněčné cytotoxicity (CCNA) jako alternativní referenční metody. Tyto metody trvají několik dní, a proto nejsou vhodné pro rutinní laboratorní testování. Rozsáhlá britská studie porovnávala toxigenní kultivaci s testováním cytotoxicity u více než 12 000 vzorků a korelovala výsledky s klinickými údaji. Zatímco zjistili, že pozitivní výsledky testu cytotoxicity korelovaly se zvýšenou mortalitou, pozitivní toxigenní kultivace s negativním testem toxicity nikoli, z čehož vyplývá, že detekce toxinu je pro klinickou diagnózu CDI rozhodující. Detekce toxinu pomocí kvalitativních enzymových imunoanalýz (EIA) bývala základem diagnostiky, nicméně tyto testy mají ve srovnání s toxigenní kultivací značná omezení v citlivosti (52-75 %), ačkoli mají ve srovnání s kultivací vyšší specificitu (96-98 %). Existuje řada dostupných komerčních laboratorních možností pro testování CDI, které jsou dobře popsány v nedávných přehledech.
Detekce glutamátdehydrogenázy: Imunoanalýza glutamátdehydrogenázy (GDH) a další molekulární testy se vyvinuly s cílem řešit nízkou citlivost mezi toxinovými EIA. Imunoanalýza GDH detekuje vysoce konzervovaný metabolický enzym přítomný ve všech izolátech C. difficile. Tento antigen je však přítomen jak u toxigenních, tak u netoxigenních kmenů C. difficile, a proto může být testování GDH pouze screeningovým krokem ve dvou- nebo třístupňovém algoritmu před specifičtějším toxinovým testem a/nebo molekulárním testem pro detekci toxinového genu.
NAAT: Ačkoli se NAAT používají ve výzkumných zařízeních od počátku 90. let 20. století, první platforma schválená americkým Úřadem pro kontrolu potravin a léčiv byla k dispozici až v roce 2009. V současné době je k dispozici nejméně 12 komerčních platforem, které detekují cílové geny včetně tcdA (gen toxinu A), tcdB (gen toxinu B) a 16S ribozomální RNA (rRNA). Tyto testy jsou citlivější než toxinová EIA a případně GDH EIA, ale méně citlivé než toxigenní kultivace.
Algoritmické vícestupňové testování a ultrasenzitivní detekce toxinů: Složitost světa testování CDI dále komplikují rozporuplné údaje o nejlepším algoritmickém přístupu k diagnostice. Vědci v jednocentrové prospektivní kohortové studii porovnávali potřebu léčby a přirozený průběh pacientů, kteří byli toxin-EIA pozitivní/PCR pozitivní (131 pacientů), s pacienty toxin-EIA negativními/PCR pozitivními (162) a toxin-EIA negativními/PCR negativními (1123). Zjistili, že toxin-pozitivní/PCR pozitivní pacienti měli více průjmů a komplikací souvisejících s CDI, zatímco skupiny toxin-negativních/PCR pozitivních a toxin-negativních/PCR negativních pacientů měly ve srovnání mezi sebou podobnou míru gastrointestinálních komplikací (7,6 % vs. 0 % vs. 0,3 %; p <0,001). Ve skupině toxin-pozitivních/PCR-pozitivních pacientů došlo k 11 úmrtím v souvislosti s CDI, ve skupině toxin-negativních/PCR-pozitivních pacientů k jednomu úmrtí a ve skupině toxin-negativních/PCR-negativních pacientů k žádnému úmrtí. Výzkumníci tedy dospěli k závěru, že samotné testování toxinů může být pro diagnostiku CDI dostačující a použití samotných testů NAAT může vést k nadměrné diagnostice a léčbě. Nicméně testování NAAT a identifikace asymptomatického nosičství má význam pro účely kontroly infekcí a epidemiologie.
Konkrétně jiná výzkumná skupina uvádí, že nepřítomnost toxinu ve stolici nemusí být prediktivní pro závažnost CDI, a proto jsou výsledky NAAT pozitivní, EIA negativní, stále klinicky významné. Výzkumníci doporučili, aby se NAAT používal jako primární diagnostická metoda CDI, ačkoli neupřesnili preferovaný diagnostický algoritmický přístup. Do této studie bylo zařazeno 296 pacientů, přičemž 143 z nich bylo klasifikováno jako skutečná CDI na základě několika různých metod. Nezjistili žádný rozdíl v pozitivitě toxinu EIA mezi pacienty s mírným vs. závažným onemocněním (49 % vs. 58 %, p = 0,31). Detekce toxinů EIA je však omezena relativně málo citlivým limitem detekce. Nejlépe fungující analytické meze detekce pro EIA se pohybují v rozmezí 0,8-2,5 ng/ml, zatímco pro testy cytotoxicity založené na buňkách byly v některých scénářích vypočteny koncentrace toxinů až 30 pg/ml. Novější studie si proto kladly otázku, zda ultrasenzitivní detekce toxinů může ve skutečnosti lépe odlišit kolonizaci od skutečné infekce s hypotézou, že kolonizace bude mít nižší hladiny toxinů.
Tato hypotéza byla testována v nedávné prospektivní studii v jednom centru, která zkoumala výkonnost ultrasenzitivního testu pro detekci a kvantifikaci toxinů C. difficile pomocí technologie single molecule array (Simoa) schopné analytické hranice přibližně 1 pg/ml a klinické hranice přibližně 20 pg/ml. Výzkumníci porovnávali koncentrace toxinů u pacientů s CDI NAAT pozitivními (n=122), kteří byli definováni jako ti, kteří měli ≥ 3 nezformované stolice během 24 hodin před odběrem stolice nebo přetrvávající průjem v klinických poznámkách, oproti asymptomatickým nosičům, kteří byli NAAT pozitivní (n=44), ale neměli hlášený průjem během 48 hodin před odběrem stolice. Vědci byli překvapeni zjištěním, že koncentrace toxinu A a B ve stolici nedokáže odlišit pacienta s CDI od asymptomatického nosiče. Mediány koncentrací toxinu A, toxinu B a toxinu A+B a prahové hodnoty cyklu NAAT (Ct) byly u obou skupin ve skutečnosti podobné. Četnosti koncentrací toxinu A+B ≥ 20pg/ml (klinická mezní hodnota) byly srovnatelné mezi skupinami CDI-NAAT+ (65 %) vs. nosič-NAAT+ (77 %). Poznamenali však, že pokud definovali skupiny CDI a nosičů nejen podle pozitivity NAAT, ale také podle pozitivity toxinu (kde toxin A + B ≥ 20 pg/ml), pak existovaly významné rozdíly v mediánu koncentrací toxinu (medián koncentrací toxinu A, B a A+B) a hodnotách Ct. V souladu s tím studie sice pozorovala, že pacienti s velmi nízkou hladinou toxinu mohou mít stále významný průjem odpovídající CDI a naopak asymptomatičtí pacienti mohou mít detekováno významné množství toxinu, ale nad hraniční hodnotou pro toxin měli asymptomatičtí pacienti nižší koncentrace detekovaného toxinu.
Shrnem se zdá, že ultrasenzitivní detekce toxinu není svatým grálem v odpovědi na otázku, jak účinněji diagnostikovat CDI a odlišit onemocnění od kolonizace. Překvapivé výsledky této studie vyvolávají zásadní otázku, proč pacienti s vysokými hladinami toxinu ve stolici mohou být asymptomatičtí a naopak pacienti s velmi nízkými hladinami toxinu mohou být symptomatičtí. Někteří odborníci předpokládají, že hostitelské faktory, jako jsou antitoxinové protilátky, mohou vysvětlovat, proč pacienti mohou být asymptomatičtí navzdory přítomnosti toxinů C. difficile ve stolici. Je možné, že pro lepší diagnostiku CDI bude zapotřebí test, který kromě detekce patogenu detekuje i takové protilátky nebo jiné biomarkery hostitele. I když netrpělivě očekáváme další výzkum v oblasti diagnostiky CDI, zůstáváme ve známé oblasti klinické medicíny, kde testy poskytují podpůrný, ale ne definitivní důkaz diagnózy, a musíme si být vědomi jejich přirozených omezení.
Výše uvedené představuje názory autora a nemusí nutně odrážet stanovisko Americké mikrobiologické společnosti.