PMC
DISCUSSION
Modelový systém DNA synthesomu obsahuje všechny proteiny potřebné k podpoře každé fáze procesu replikace DNA a tyto proteiny mají za současných podmínek testu velikost od 20 do 240 kDa a mohou provádět všechny fáze procesu replikace DNA in vitro . V této studii byla charakterizována aktivita DNA primázy asociované se synthesomem zkoumáním syntézy a prodlužování RNA primerů katalyzovaných in vitro DNA synthesomem. Výsledky našich funkčních analýz ukazují, že aktivita DNA primázy asociované se synthesomem ve frakci P4 získané z buněk rakoviny prsu je 30krát vyšší než aktivita surových extraktů buněk rakoviny prsu. Frakce P4 obsahující DNA synthesom byla získána z kombinované jaderné a cytoplazmatické rozpustné proteinové frakce připravené z buněk MCF7 a byla použita k provedení testu replikace DNA SV40 in vitro . Aktivity DNA polymerázy α a δ a DNA primázy ve frakci P4 jsou 20-40krát vyšší než v surových buněčných extraktech ; což z ní činí užitečný nástroj pro tyto studie, protože je plně způsobilá podporovat syntézu a prodlužování RNA primerů v modelovém systému in vitro, který prokazatelně podporuje všechny fáze procesu replikace DNA .
DNA primáza vykazuje jedinečnou procesivitu při syntéze a prodlužování RNA primerů. Tato procesivita je definována soutěží mezi přidáním dalšího správného nukleotidu a disociací komplexu primer-templát . DNA primáza je jediným enzymem schopným syntetizovat RNA primery během iniciace syntézy DNA . Ani jedna z jednotlivých podjednotek primázy není schopna samostatně syntetizovat nebo prodlužovat RNA primer . Synthesom obsahuje obě podjednotky primázy (tj. p49 a p58) a může katalyzovat syntézu RNA primerů in vitro s použitím exogenního poly(dT) templátu. Synthesom syntetizuje funkční RNA primer o jednotkové délce (7-10 nt). Tyto RNA primery jsou zcela hydrolyzovány RNázou na krátké fragmenty o délce 1-4 bp, ale nejsou hydrolyzovány DNázou. Charakteristickým rysem primázy spojené se syntézou, který ji odlišuje od izolované DNA primázy, je její specifická schopnost prodlužovat RNA primer za vzniku DNA-primerového vlákna. Syntéza DNA-primerového vlákna vyžaduje kromě aktivity DNA-primasy také aktivitu DNA-polymerasy. Aktivita DNA polymerázy se obvykle přepíná tak, aby po syntéze primeru RNA zahájila prodlužování primeru RNA. Polymeráza využívá pouze RNA primery dlouhé ≥ 7 nukleotidů; bez ohledu na koncentraci dNTP . Syntéza a prodlužování RNA primeru jednotkové délky tedy nevyžaduje pouze primázu, ale podílí se na ní také podjednotka DNA polymerázy α p180 , přičemž syntéza obsahuje vysoce aktivní DNA polymerázy, které katalyzují inkorporaci deoxyribonukleotidů k prodloužení RNA primeru. RNA primery jsou prodlužovány polymerázami spojenými se synthesomem z oligoprimeru DNA-RNA o délce 20-40 nt (DNA primer). DNA-primerová vlákna obsahují dvě složky: (1) ribonukleotid o délce 10 nt a (2) deoxyribonukleotid o délce 20-40 nt. RNáza a DNáza odděleně hydrolyzují příslušné složky řetězců DNA-primer, což vede ke zkrácení, ale neúplné hydrolýze řetězce DNA-primer.
Další vlastností syntézy je rychlá syntéza a odlišné velikosti RNA primeru a řetězce DNA-primeru. Syntezom katalyzuje syntézu jak RNA primeru, tak DNA-primerového vlákna rychle a zdá se, že ustálené hladiny se akumulují během (5-15 min). Velikost RNA primeru o jednotkové délce (7-10 nt) a DNA-primerového vlákna (20-40 nt) katalyzovaného syntézou DNA zůstává vždy konstantní bez ohledu na koncentraci syntézy nebo dobu reakce. Z této studie mechanismu aktivity DNA primázy vyplývá, že syntéza RNA primerů, katalyzovaná primázou asociovanou se synthesomem, probíhá prostřednictvím pomalé iniciace, rychlé polymerizace a „inteligentního“ ukončení primeru . DNA primáza váže templát DNA a pomalu iniciuje syntézu dinukleotidu. Po syntéze dinukleotidu se k dinukleotidu polymerizovanému primázou DNA rychle přidávají další NTP. Aktivita DNA primázy je charakterizována syntézou každého primeru RNA v jediném „výbuchu“ aktivity, nikoli prostřednictvím distributivní syntézy . Jakmile jsou vytvořeny primery o jednotkové délce 7-10 nt, působí primáza-šablona jako ukončovací signál a inhibuje další syntézu RNA. Tato inhibice je způsobena vytvořením stabilní primerové šablony, která pravděpodobně zůstává spojena s komplexem pol α-primáza. Je zajímavé, že DNA-primární vlákna syntetizovaná syntézou DNA in vitro jsou podobná syntézou katalyzovaným RNA primerům syntetizovaným in vitro. Syntéza DNA-primerového vlákna dosahuje rychle ustálených hodnot a velikost DNA-primerového vlákna zůstává relativně konstantní (mezi 20 a 40 nt) bez ohledu na dobu reakce nebo koncentraci syntézy použité během syntézní reakce. Syntéza DNA-primerového vlákna vyžaduje kromě DNA-primasy také aktivitu DNA-polymerázy α . Naše výsledky naznačují, že aktivita polymerázy α spojená se syntézou se rovněž vyznačuje rychlou polymerací a „inteligentním“ ukončením syntézy DNA-primerového vlákna. Syntéza s rysem rychlé polymerizace a inteligentní terminace DNA-primerového vlákna se liší od syntézy medikované Klenowovým fragmentem DNA polymerázy I E. coli při prodlužování RNA primeru. Na rozdíl od syntézy je prodlužování primeru RNA katalyzované polymerázou I silně závislé na délce reakční doby. Prodloužení reakční doby výrazně zvyšuje množství a velikost prodlužovaných primerů RNA.
Byly navrženy dva potenciální mechanismy, které vysvětlují přechod od syntézy primerů k jejich prodlužování během procesu replikace DNA . První navrhuje, že komplex primáza-polymeráza disociuje od primerové šablony a znovu se spojí s aktivním místem polymerázy. Druhý navrhuje, že k přepnutí dochází při intrastrandové translokaci komplexu pol α-primáza z aktivního místa primázy do aktivního místa polymerázy α. Toto přepnutí nezahrnuje disociaci komplexu pol α-primáza od templátu DNA. Naše experimenty ukazují, že polymerázou I katalyzované prodlužování RNA primeru je inhibováno vysokými koncentracemi DNA syntézy. Schopnost Klenowova fragmentu prodlužovat RNA primer závisí na syntéze RNA primerů katalyzované syntézou, která rovněž potřebuje dostupné vazebné místo na konci RNA primeru. Proto Klenowův fragment polymerázy I E. coli vyžaduje disociaci komplexu primáza-polymeráza od primer-templátu. Vysoké koncentrace syntézy však soutěží s polymerázou I o vazebné místo na primer-templátu, takže prodlužování RNA primeru je inhibováno. Synthesom vytváří mrtvý komplex na zakončení RNA primeru; výsledkem je neschopnost Klenowova fragmentu účastnit se procesu prodlužování RNA primeru. Tento výsledek naznačuje, že komplex polymeráza-primáza DNA synthesomu musí po syntéze RNA primeru disociovat od primer-templátu. Náš výsledek ukazuje, že syntézom zvětšuje velikost RNA primeru o jednotkové délce při snížení reakční teploty. Snížení reakční teploty zvyšuje účinnost přepojení komplexu polymeráza-primáza a snižuje denaturaci primer-templátu . Kromě toho podjednotka DNA primase p49 obsahuje katalytickou aktivitu RNA polymerasy, potřebnou ke zvětšení velikosti RNA primeru jednotkové délky . Naše výsledky tedy naznačují, že syntéza DNA má příslušnou aktivitu RNA polymerázy potřebnou k tvorbě fragmentů DNA s RNA primerem.
Kinetická analýza iniciace a elongace RNA primeru ukazuje, že DNA primáza asociovaná se syntézou je pomalý a relativně slabý enzym s ohledem na vazbu templátu . DNA primáza je také polymeráza nukleových kyselin náchylná k chybám, protože tento enzym má velmi slabou schopnost rozlišovat nukleotidy; výsledkem je chybná inkorporace nukleotidů . Proto by naše analýza enzymatické kinetiky aktivity DNA primasy spojené se syntézou mohla být použita k určení vztahu rychlosti syntézy a četnosti chyb při syntéze RNA primerů. Přerušovaná syntéza fragmentů DNA (Okazaki) na opožděném vlákně replikační vidlice je důležitým biochemickým procesem během replikace DNA. Aby byla zajištěna účinná koordinace mezi kontinuální syntézou DNA na vedoucím vlákně a diskontinuální syntézou DNA na opožďujícím se vlákně, vyžaduje DNA primase přesně načasovanou řadu enzymatických kroků, které řídí syntézu RNA primeru. Kinetická studie multiproteinového replikačního komplexu z bakteriofága T7 ukazuje, že primáza funguje jako molekulární brzda a přechodně zastavuje postup replikační vidlice . Vzhledem k fyzikální interakci DNA polymerázy δ s pol α výsledek prezentovaný Lee et al. naznačuje, že DNA primáza může být schopna zabránit tomu, aby syntéza vedoucího vlákna předstihla syntézu opožděného vlákna během pomalých enzymatických kroků na opožděném vlákně.
Při studiu funkce DNA primázy byly použity různé modely replikace eukaryotické DNA. Systém replikace v jaderné matrici celého buněčného lyzátu byl použit ke zkoumání syntézy a distribuce nativního RNA primeru a RNA-primované nascentní DNA v jádrech eukaryotických buněk pomocí endogenního dvouřetězcového DNA templátu vázaného v jaderné matrici . RNA primery jsou pevně spojeny s jadernou matrix rychle se množících savčích buněk . RNA primery jsou kovalentně navázány na nově replikovanou DNA a vytvářejí RNA-primed nascentní DNA. RNA-primed DNA se po štěpení DNázou rozkládá na některé oligoribonukleotidy o délce ~10 nt , přičemž nejméně 94 % nativních RNA primerů a RNA-primed nascentní DNA se nachází v nerozpustné frakci matrix jádra. RNA primery o délce 8-10 nt, které se nacházejí spojené s jadernou matrix, tvoří <1 % celkové RNA v buňce ; proto je velmi obtížné zkoumat RNA primery a RNA-primovanou nascentní DNA ve frakci jaderné matrix buňky vzhledem k velmi nízké koncentraci RNA primerů a relativně velkému množství jiných RNA. Izolace RNA primerů a RNA-primed nascentní DNA z celobuněčných lyzátů značených radionukleotidy je navíc složitý a netriviální purifikační postup, pokud se použije pro analýzu syntézy RNA primerů zprostředkované modelem replikace jaderné matrice. Naproti tomu syntéza DNA purifikovaná z kombinované jaderné a cytoplazmatické frakce obsahuje vysoce aktivní DNA primázu a DNA polymerázy a plně podporuje syntézu nativních RNA primerů in vitro s použitím dvouřetězcového DNA templátu obsahujícího původ SV40. Syntézou DNA syntetizované RNA primery mají normální délku (10-20 nukleotidů) a zdá se, že správně fungují a podporují prodlužování primerů DNA polymerázou. Tyto RNA primery lze snadno prodloužit za vzniku RNA-primární nascentní DNA o délce 100-200 nt. Přerušovaná syntéza fragmentů DNA (Okazaki) na opožděném vlákně replikační vidlice je důležitým biochemickým procesem, který se podílí na replikaci DNA, a fragmenty DNA (Okazaki) s plnou délkou RNA-primed syntetizované syntézou DNA mají rovněž délku přibližně 100-200 nukleotidů . Pozorovali jsme, že syntézom DNA může syntetizovat různé RNA primed produkty o velikosti od 10 do 200 nt délky. To lze považovat za přiměřené, protože nativní RNA primery a RNA-primovaná nascentní DNA mají rovněž tuto přibližnou délku. Výše uvedené pozorování, že syntéza RNA primerů a RNA-primed nascentní DNA katalyzovaná DNA synthesomem je v podstatě ekvivalentní se studií publikovanou s použitím modelu replikace jaderné matrice z celobuněčného lyzátu , naznačuje, že DNA synthesom je vynikající modelový systém schopný provádět fyziologicky významný proces replikace DNA in vitro.
Model DNA synthesomu je proto jedinečným a cenným nástrojem při studiu funkce DNA primasy. Syntéza a prodlužování primerů RNA zprostředkované primázou prováděné syntézou DNA se velmi podobá syntéze a prodlužování prováděnému jinými bezbuněčnými replikačními modely. Syntezomový model podporuje syntézu a prodlužování RNA primerů in vitro za použití exogenních jednořetězcových DNA templátů i superzavinuté dvouřetězcové DNA obsahující intaktní replikační původ SV40. Syntezom DNA je tedy plně schopen zprostředkovat syntézu a prodlužování primerů RNA in vitro a může usnadnit další zkoumání mechanismů iniciujících syntézu DNA v eukaryotických buňkách. Naše výsledky společně naznačují, že model synthesomu poskytuje jedinečný nástroj pro studium interakce DNA primázy a dalších replikačních proteinů během procesu replikace DNA.