The genetic variation of different developmental stages of Schistosoma japonicum : do the distribution in snails and pairing preference benefit the transmission?
Sběr vzorků
Sběr vzorků a plán experimentu jsou shrnuty na obr. 1. Níže jsou popsány kroky sběru vzorků, včetně sběru plžů, sběru cerkarií, sběru myší infekce a dospělých červů a sběru miracidií.
Schéma sběru vzorků a experimentálního plánu
Sběr hlemýžďů
Hlemýždi rodu Oncomelania hupensis byli sbíráni v březnu a září 2016 ve východní oblasti jezera Dongting (29° 32′ 5. st.25″ s. š., 112° 52′ 35,00″ v. d.), provincie Hunan, Čína. Plži byli nalezeni v příkopech ve 3 vesnicích ve vzdálenosti 10 km. Místem sběru je bažina, nikoli národní park nebo jiné chráněné území či soukromý pozemek. Sběr byl proveden se souhlasem a za pomoci Institutu pro kontrolu schistosomózy provincie Hunan v Číně, který dohlíží na kontrolu plžů v této oblasti. Oncomelania hupensis není ohroženým ani chráněným druhem. Hlemýždi byli přivezeni zpět do laboratoře a klasifikováni jako skupina A u hlemýžďů sebraných v březnu a skupina B u hlemýžďů sebraných v září. Po měsíci chovu v zajetí byli plži omyti a přeneseni do jednotlivých lahviček naplněných vodou na 3 hodiny pod světlem při 25 °C, aby se stimuloval vznik cerkarií pro identifikaci infekce S. japonicum. Nakonec bylo 20 plžů ze skupiny A a 25 plžů ze skupiny B identifikováno jako infikovaní S. japonicum.
Sběr cerkárií
Po uvolnění cerkárií z jednotlivých plžů byly některé přeneseny do misky pomocí kličky a promyty v roztoku na promývání cerkárií (5 g/l hydrolyzátu laktalbuminu, 6,8 g/l NaCl, 0,4 g/l KCL, 0,2 g/l CaCl2, 0,2 g/l MgSO4-7H2O a 1 g/l glukózy) pod mikroskopem. Po třech promýváních byly cerkárie jednotlivě pipetovány 2 μl sterilizovaného promývacího roztoku na kartu Whatman™ FTA (GE Healthcare, Pittsburgh, USA). Po vysušení byly karty uloženy v uzavřeném plastovém sáčku v exsikátoru při pokojové teplotě. Na kartách Whatman™ FTA bylo jednotlivě shromážděno a uloženo nejméně 50 cerkárií z každého plže.
Infekce myší cerkáriemi z jednotlivých plžů
Pro rozlišení plžů infikovaných jedním pohlavím S. japonicum byly peroperačně infikovány 2 laboratorní myši Kunming 30 cerkárii z každého plže na myš. Celkem bylo infikováno 40 myší pro 20 plžů skupiny A a 50 myší pro 25 plžů skupiny B. Červi byli odebráni z mezenterických žil každé myši perfuzí pomocí 0,9% NaCl a pitvou po 7 týdnech od infekce. Bylo dbáno na to, aby se minimalizovala možnost rozdělení párových dospělých červů způsobená mechanickou silou během perfuze a pitvy, a to za použití 3 zkušených techniků, kteří zpracovávali červy co nejrychleji. Každý pár červů byl přenesen do samostatných zkumavek k okamžitému promytí a označení a po samovolném oddělení byl uložen v absolutním ethanolu v párech. Nepároví červi z každé myši byli zkontrolováni pod mikroskopem pro potvrzení pohlaví a poté uloženi v etanolu.
Infekce myší cerkáriemi sdruženými ze všech plžů (metoda I a II) a sběr dospělých červů
Pro následné infekce zůstalo 17 z 20 plžů ze skupiny A a 16 z 25 ze skupiny B živých a schopných produkovat dostatečné množství cerkárií. Pro obě skupiny plžů byly použity dvě různé metody sdružování cerkarií. U zbývajících 17 plžů ze skupiny A byli všichni plži společně shromážděni v baňce s vodou, aby se stimuloval vznik cerkarií (metoda I). Třicet jedna myší bylo poté infikováno perkutánně 34 cerkáriemi pro každou myš. Pro infekci pomocí 16 plžů skupiny B byly 2 cerkárie z každého plže vylučujícího se jednotlivě spojeny dohromady a smíšených 32 cerkárií bylo použito k infekci myši (metoda II), přičemž se opakovaně infikovalo celkem 22 myší. Všechny myši byly usmrceny za účelem sběru červů S. japonicum 7 týdnů po infekci, jak je popsáno výše. Nakonec bylo shromážděno 530 červů od myší metodou I (skupina A), 484 červů od myší metodou II (skupina B).
Sběr miracidií
Předtím, než byly všechny infikované myši usmrceny za účelem sběru dospělých červů, byla po dobu 7 dnů sbírána stolice od každé myši, aby se soustředila vajíčka vyloučená střevem pro líhnutí miracidií. Sediment vajíček z každé myši byl vystaven působení dechlorované vody v baňce pod světlem při teplotě 25 °C, aby se vylíhly miracidie. Miracidie byly z horní vody každé baňky odebrány pipetou a přeneseny do misky s promývacím roztokem miracidií (5 g/l hydrolyzátu laktalbuminu, 6,5 g/l NaCl, 0,14 g/l KCl, 0,12 g/l CaCl2 a 0,20 g/l NaHCO3). Po třech promýváních byly miracidie jednotlivě pipetovány 2 μl sterilizovaného promývacího roztoku na kartu Whatman™ FTA. Po vysušení byla karta uložena v uzavřeném plastovém sáčku v exsikátoru při pokojové teplotě. Bylo odebráno nejméně 50 miracidií na jednu myší stolici.
Miracidie vylíhlé z vajíček zachycených v játrech infikovaných myší byly rovněž odebrány následujícím způsobem. Játra každé infikované myši byla po sběru dospělých červů odebrána, homogenizována ve studené 1,2% NaCl a přefiltrována, aby se získal sediment vajíček. Miracidie byly vylíhnuty stejnou metodou, jaká byla použita pro vzorek stolice. Nakonec bylo jednotlivě pipetováno nejméně 50 miracidií na játra myši a uloženo na karty Whatman™ FTA.
Extrakce genomové DNA
Pro získání DNA z jednoho vzorku cerkárie nebo miracidie byl ze středu pipetovací plochy každého vzorku na kartě Whatman™ FTA odebrán disk o průměru 2 mm pomocí 2 mm Harris Micro-punch (GE Healthcare Life Sciences, Stevenage, UK). Disk byl umístěn na dno 96jamkové destičky o objemu 1,2 ml s U-dnem. Po jednom promytí 100 μl purifikačního činidla FTA (GE Healthcare Life Sciences) po dobu 5 minut, následovaném 100 μl TE pufru (10 mM Tris-Cl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0), bylo do každé jamky přidáno 14 µl 0,1 M NaOH s 0,3 mM EDTA, pH 13,0 a roztok byl ponechán inkubovat po dobu 5 minut, poté bylo přidáno 26 µl 0,1 M Tris-HCl pufru, pH 7,0. Poté byla destička promíchána třikrát pulzním mícháním vířivým míchadlem po dobu přibližně 10 s. Roztok byl poté ponechán 10 min při pokojové teplotě, 10krát pulzně vortexován a eluát byl přenesen do čisté 96jamkové destičky a pro další použití uložen při -20 °C.
Při mikroskopování jednotlivých dospělých červů byla od každé dospělé samice odříznuta přední část včetně dělohy, aby se zabránilo vlivu vajíček v děloze na genotyp samice. Zatímco pro extrakci DNA byli použiti celí samci nebo nedospělé samice. Celková genomová DNA byla extrahována z každého červa zvlášť pomocí standardního postupu dodecylsulfát sodný-proteináza K následujícím způsobem. Každý červ byl inkubován a rozmražen ve 400 μl extrakčního pufru obsahujícího 50 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1 % SDS a 100 mg/ml proteinázy K při 56 °C po dobu 1 hodiny za mírného míchání. DNA v roztoku byla extrahována pomocí standardní purifikace fenol/chloroform, následované 3 M octanem sodným (pH 5,2) a srážením ethanolem. Pelety DNA byly promyty v 70% ethanolu, vysušeny na vzduchu a resuspendovány ve 20 μl TE (pH 8,0) a uloženy při -20 °C jako surový extrakt DNA dospělého červa pro další použití.
PCR amplifikace a mikrosatelitní genotypizace
Pro potvrzení existence genomové DNA v eluci z karty FTA nebo v surovém extraktu z ethanolem skladovaného vzorku byl z roztoku DNA jedné cerkárie, miracidia nebo dospělého červa amplifikován fragment genu 28S ribozomální DNA pomocí následujících primerů: (5′-GTG GAG TTG AAC TGC AAG C-3′) a reverzní (5′-GCT CAA CAW TAA TAG TCA AAC CTG-3′). PCR byla provedena pomocí kuliček Illustra PuReTaq Ready-To-Go PCR Beads v 96jamkové destičce (GE Healthcare Life Sciences, USA). Ke každé kuličce byly přidány 2 µl eluce FTA z jedné larvy nebo 0,5 µl surového extraktu z jednoho červa, 1 µl každého primeru a voda do konečného objemu 25 µl. Amplifikace byla provedena pomocí následujícího programu: 95 °C po dobu 5 min; následovalo 40 cyklů po 30 s při 95 °C, 30 s při 60 °C a 40 s při 72 °C; a závěrečný krok prodloužení při 72 °C po dobu 7 min. Reakce byly poté zkontrolovány spuštěním 5 µl na 2% agarózovém TAE gelu.
Genotypizace v malém měřítku byla provedena pro 30 cerkárií, 30 miracidií a 30 červů, kteří byli vybráni náhodně, aby byl sestaven optimální panel multiplexních mikrosatelitních lokusů pro amplifikaci PCR. Bylo zkontrolováno dvacet lokusů vyvinutých a validovaných v předchozích studiích a z naší laboratoře. Nakonec bylo vybráno 9 mikrosatelitních lokusů (doplňkový soubor 1: tabulka S1), z nichž byl vytvořen panel. Mikrosatelitní lokusy pro každý vzorek DNA byly genotypizovány pomocí soupravy Type-it Microsatellite PCR kit (Qiagen, Manchester, UK) s multiplexem 9 lokusů. Přední primer každého páru byl označen příslušným fluorescenčním barvivem, včetně 6-FAM, HEX, TAMRA a ROX (doplňkový soubor 1: tabulka S1). PCR reakce byly připraveny v 96jamkové PCR destičce s použitím 6,25 μl 2× master mixu, 1,25 μl Q roztoku, 0,5 μl primerů (10 μM), 2 μl DNA templátu a 2,5 μl ddH2O, poté byly provedeny v termocykleru Bio-Rad s následujícím programem: °C po dobu 5 min; následuje 35 cyklů po 30 s při 95 °C, 90 s při 60 °C a 3 min při 72 °C; následuje závěrečný krok prodloužení při 60 °C po dobu 45 min. PCR reakce byly zkontrolovány nanesením 5 µl na 2% TAE agarózový gel a úspěšné amplifikace byly odeslány do společnosti Sangon Biotech (Šanghaj, Čína) k analýze fragmentů na genetickém analyzátoru ABI3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Genotypy byly vyhodnoceny pomocí mikrosatelitového pluginu Geneious 11.0 . Všechny vzorky byly amplifikovány a genotypovány dvakrát, aby se snížila odchylka. Celkem byly pro následující analýzy získány genotypy 346 cerkárií, 701 dospělých červů a 393 miracidií.
Analýzy genetické diverzity
Genetická diverzita každého lokusu byla odhadnuta u všech genotypovaných cerkárií výpočtem pozorovaného počtu alel (Na), efektivního počtu alel (Ae) v GenAlEx 6.5 a alelické bohatosti (Ar) a genové diverzity (Hs) v hierfstat ver. 0.04-22 , zahrnující 156 cerkárií od 20 plžů skupiny A a 190 cerkárií od 25 plžů skupiny B. Odchylka od Hardy-Weinbergovy rovnováhy (HWE) pro každý lokus byla testována pomocí chí-kvadrát testu v GenAlEx a test vazebné nerovnováhy mezi lokusy byl vypočten v SHEsis .
Na, Ae, Ar a Hs byly vypočteny pro různé populace v průběhu infekce myší následovně. Pro cerkáriové populace použité při infekci bylo vyhodnoceno 132 cerkárií ze 17 plžů skupiny A (použitých v metodě I) a 122 cerkárií ze 16 plžů skupiny B (použitých v metodě II). Po genotypizaci a odfiltrování nekvalitních dat bylo úspěšně genotypováno nejméně 5 párů dospělých červů (pokud byli přítomni) a všichni nepároví červi z každé myši. Celkem bylo zahrnuto 357 červů od myší v metodě I (s použitím cerkárií ze 17 sdružených plžů skupiny A), 344 červů od myší v metodě II (s použitím stejně smíšených cerkárií ze 16 jednotlivých plžů skupiny B). Kromě toho byla odhadnuta genetická diverzita dospělých červů u každé myši, aby se zkontrolovala alelická konzistence dospělých červů mezi myšmi v metodě I a II zvlášť. U populací miracidií byla genetická diverzita miracidií z jater a stolice vypočtena na nadpopulační úrovni (miracidie z jater nebo stolice všech myší), protože u každé myši byly genotypovány pouze 3-4 miracidie z jater nebo stolice, včetně 93 miracidií z jater (3 na myš) a 124 miracidií ze stolice (4 na myš) u metody I a 88 miracidií z jater i stolice (4 na myš zvlášť) u metody II.
Analýza molekulárního rozptylu (AMOVA)
Genetická diferenciace všech genotypovaných cerkarií ze skupiny A a skupiny B byla odhadnuta pomocí AMOVA v programu Arlequin ver. 3.5.2.2 . Po vyloučení plžů, kteří nebyli použiti k infekci myší, byla testována diferenciace 132 cerkarií ze 17 plžů ze skupiny A (pro metodu I) a 122 cerkarií ze 16 plžů ze skupiny B (pro metodu II). Po infekci byla testována diferenciace mezi 357 dospělými červy u metody I a původní populací cerkárií (132 cerkárií ze skupiny A). Také 344 červů v metodě II bylo testováno proti 122 cerkariím ze skupiny B. Kromě toho byla zvlášť hodnocena odlišnost dospělých červů mezi 31 myšmi v metodě I a dospělých červů mezi 22 myšmi v metodě II. U miracidií byla testována genetická diferenciace mezi 93 miracidiemi z jater a 124 miracidiemi ze stolice v Metodě I a totéž u 88 miracidií z jater i ze stolice v Metodě II.
Analýza příbuznosti pro singletony cerkárií s niMLG
Byl spočítán počet genotypů cerkárií od každého plže. Protože je obtížné odlišit typizační chyby nebo somatické mutace během množení sporocyst od původního genotypu miracidií, byla skupina genotypů cerkarií s méně než 2 neshodnými alelami identifikována jako niMLG a přiřazena k linii odvozené od stejné miracidie u každého plže. Nakonec byl na základě počtu linií vyhodnocen počet miracidií, které vytvořily genetické klony u každého plže, pomocí balíčku R allelematch ver. 2.5 .
Protože se předpokládalo, že cerkárie s niMLG v jednom plži pocházejí z jednoho miracidia , byl jeden z genotypů (singleton) pro niMLG přiřazen jako reprezentant skupiny cerkárií, které pocházejí z miracidia pomocí funkce amCluster v allelematch, aby vznikl filtrovaný soubor dat pro analýzu příbuznosti mezi miracidii. Poté byla příbuznost mezi singletony (miracidiemi) odhadnuta pomocí korelačního koeficientu velikosti alel (I′) podle Streiffa v SPAGeDi ver. 1.5a na úrovni uvnitř plže a mezi plži pro 20 plžů ve skupině A a 25 plžů ve skupině B, aby se zjistilo, zda agregace miracidií v jednom plži koreluje s genetickou podobností miracidií.
Rozložení alel pro podskupiny cerkárií z různého počtu plžů
Nejednotné genetické rozložení cerkárií mezi plži znamená, že velikost vzorku plžích hostitelů by ovlivnila rozložení alel v suprapopulaci cerkárií (cerkárie ze všech plžů). Na, základní index pro indikaci genové početnosti populace , byl dále hodnocen pro každý lokus v různých podsouborech cerkarií náhodným výběrem různého počtu plžů. Slimáci byli vybráni náhodně při každém daném počtu slimáků, který byl nastaven od 1 do maxima v každé skupině pomocí základní funkce sample v R, se 100 opakováními. V rámci každého opakování byl počet cerkárií v každém plži nastaven na 5, což bylo stanoveno podle praktické proveditelnosti a průměrného počtu cerkárií genotypovaných v každém plži v této studii. Genotypy cerkarií pro stejný počet plžů byly sloučeny a Na byl poté odhadnut pro každý lokus pomocí funkce nb.alleles v balíčku R hierfstat. Relativita mezi genetickou diverzitou a počtem plžů byla vyhodnocena výpočtem nejmenší velikosti vzorku plžů při nastavení 50 % a 95 % celkového Na.
Genetická vzdálenost mezi samicemi a samci dospělých červů
Pro zjištění potenciální genetické preference S. japonicum při páření byla pomocí Populations ver změřena interindividuální genetická vzdálenost Dsw mezi samcem a samicí každého páru u jednotlivých myší. 1.3.32 (http://www.bioinformatics.org/~tryphon/populations/) a porovnána s odstupem mezi párovou samicí a nepárovými červy (pokud jsou k dispozici, nepároví jsou většinou samci) ve stejném hostiteli.
Identifikace otcovství u miracidií
Frekvence alel všech dospělých červů a miracidií u každé myši byly analyzovány a vypočteny pomocí funkce Alle Frequency Analysis v programu Cervus 3.0 . Všech 9 lokusů bylo nakonec vyhodnoceno jako vhodné markery pro další analýzu rodičovství s kombinovanou pravděpodobností nevyloučení menší než 0,01 %. Funkce Simulace analýzy rodičovství byla použita na základě frekvence alel, aby se odhadla rozlišovací schopnost kodominantních lokusů a kritické hodnoty logaritmické pravděpodobnosti (LOD) s následujícími předpoklady: 10 000 potomků (miracidií) pro každou jednotlivou myš; 10 kandidátních matek a otců u každé myši (odhad velikosti vzorku podle počtu dospělých červů odebraných v hostiteli); podíl kandidátů byl nastaven na 100 % genotypovaných dospělých červů; ostatní možnosti byly nastaveny standardně. Nakonec byly oba výstupy z analýzy frekvence alel a simulace analýzy rodičovství uvedeny v modulu analýzy rodičovství, aby bylo možné přiřadit každého potomka k jeho nejpravděpodobnějším rodičům. Rodiče, kteří měli více než 2 neshodné alely s potomky, byli vyloučeni a ti, kteří měli největší LOD, byli považováni za nejpravděpodobnější rodiče.
Statistická analýza
Veškeré údaje použité ve statistické analýze v této studii jsou spojité údaje. Významnost rozdílu v indexech genetické diverzity (Na, Ae, Ar a Hs) lokusů, koeficientu příbuznosti (I′) a interindividuální genetické vzdálenosti (Dsw) mezi dvěma skupinami byla hodnocena na hladině významnosti 0,05. V případě, že se jednalo o genetickou diverzitu, byla použita hladina významnosti 0,00. Nejprve bylo pomocí Sharpiro-Wilkova testu zkontrolováno normální rozdělení datových souborů. Poté byl použit párový/nezávislý t-test, pokud soubory dat vyhověly normálnímu rozdělení. V opačném případě byly pro příbuzné/nezávislé vzorky použity Wilcoxonův signed-rank test a Mannův-Whitneyho U-test. Pro korekci hodnoty P při vícenásobném porovnání byla použita Bonferroniho korekce.
.