Transmigrované neutrofily ve střevním lumen zapojují ICAM-1 k regulaci epiteliální bariéry a náboru neutrofilů

Transmigrované neutrofily ve střevním lumen zapojují ICAM-1 k regulaci epiteliální bariéry a náboru neutrofilů

ICAM-1 podporuje adhezi a lokomoci PMN na apikální epiteliální membráně za podmínek zánětu

V kryptových abscesech, jak je pozorováno u aktivní IBD, jsou PMN infiltrující střevní krypty často pozorovány v intimním kontaktu s apikálním (luminálním) povrchem epitelu.14 Abychom prozkoumali interakce PMN-IEC během pozdních stadií TEM, modelovali jsme migraci PMN přes střevní epitel za zánětlivých podmínek pomocí dříve popsaného transwellového uspořádání.19 TEM PMN ve fyziologickém směru od bazolaterálního k apikálnímu povrchu přes kontrolní nebo interferonem-γ (IFNγ) ošetřené T84 IECs byla vyvolána přidáním transepiteliálního gradientu N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLF) (100 nM). Vystavení T84 IECs působení IFNγ (100 U ml-1, 24 h) nemělo významný vliv na bariérovou funkci IEC ani na expresi a subcelulární lokalizaci klíčových junkčních proteinů JAM-A, Occludin a ZO-1 (doplňkový obrázek S1 online). Léčba IFNγ neměla významný vliv na počet PMN, které dokončily TEM; významně však zvýšila počet apikálně asociovaných PMN (z 8,7±1,8 %, bez léčby, na 19,7±1,9 %, IFNγ, apikálně, obr. 1a). V souladu s tímto zvýšením byl počet nemigrovaných PMN (PMN v horní komůrce, bazálně) po léčbě IFNγ významně snížen (∼1,5krát), což naznačuje zvýšenou rychlost migrace (obr. 1a). Počet PMN v epiteliální monovrstvě (epith) se nezměnil. Reprezentativní konfokální imunofluorescenční snímky (Obrázek 1b, horní panely) a z-projekce (spodní panely) ukazují apikálně asociované PMN po migraci přes IFNγ stimulované, ale nikoli kontrolní monovrstvy T84. Jelikož bylo dříve prokázáno, že IFNγ indukuje expresi ICAM-1 v zaníceném epitelu27 , předpokládali jsme, že během zánětu zůstávají PMN migrující přes epiteliální monovrstvy přichyceny k apikální membráně prostřednictvím interakcí závislých na Mac-1 a ICAM-1, a proto budou schopny lokomoce závislé na ICAM-1, jak bylo dříve pozorováno u cévního endotelu24 , 28 V potvrzení předchozích zjištění vyvolala léčba IFNγ (100 U ml-1, 24 h) robustní, na čase závislé zvýšení exprese ICAM-1 (s vrcholem 24 h po léčbě, obr. 1c,d) na apikální membráně T84 IEC (obr. 1e). Tento účinek byl specifický pro IFNγ, protože vystavení IEC T84 a SKCO15 tumor nekrotizujícímu faktoru-α (TNFα; 10 ng ml-1) expresi ICAM-1 nevyvolalo (doplňkový obrázek S2A,B). Zvýšená regulace ICAM-1 byla pozorována také v kryptovém epitelu biopsií tlustého střeva od pacientů s aktivní ulcerózní kolitidou ve srovnání se zdravou sliznicí (obrázek 1f). Dále se potvrdila adheze PMN závislá na ICAM-1 a Mac-1 k apikálním membránám IEC, přidání protilátek proti ICAM-1 nebo proti Mac-1 blokujících funkci (Abs; 20 μg ml-1) zvrátilo zvýšení adheze PMN vyvolané IFNγ (doplňkový obrázek S3A). Je zajímavé, že inhibice PMN Mac-1 vedla k silnějšímu snížení (>3krát) adheze PMN ve srovnání s inhibicí ICAM-1, což naznačuje, že Mac-1 váže kromě ICAM-1 i další ligandy na povrchu epitelu.

Dále jsme zkoumali, zda apikálně adherované PMN po překročení epitelu vykazují apikální lokomoci. Fázově kontrastní časosběrná mikroskopie byla použita ke sledování a kvantifikaci chování jednotlivých PMN přichycených k apikální membráně IEC. PMN v nepřítomnosti exogenního podnětu vykazovaly malý pohyb, avšak 59,3±7,6 % apikálně asociovaných PMN po migraci přes IEC vykazovalo vysoce pohyblivé chování (obr. 2a) s průměrnou vzdáleností plazení 65,6±6,2 μm (obr. 2b). TEM vyvolala výrazné zvýšení exprese Mac-1 na povrchu buněk PMN (obrázek 2c), což odpovídá jeho roli v apikálních interakcích mezi PMN a IEC. Důležité je, že počet PMN vykazujících apikální lokomoce se významně zvýšil, když byly IEC stimulovány IFNγ k upregulaci ICAM-1 (88±3,6 %, IFNγ, vs. 59,3±7,6 %, neošetřené IEC). Za těchto podmínek PMN urazily významně delší vzdálenost (101±10,0 μm, IFNγ, vs. 65,6±6,2 μm, neošetřené IEC, obr. 2b) podél apikální epiteliální membrány. Úlohu ICAM-1 při zprostředkování lokomoce PMN potvrdilo přidání funkčně blokující protilátky proti ICAM-1 (Ab), která zvrátila účinky IFNγ a snížila počet i vzdálenost, kterou PMN urazily (61,4±7,8 % a 73,6±6,1 μm, obr. 2a,b). Inhibice Mac-1 zrušila lokomoci zbývajících adherovaných PMN (obr. 2a a doplňkové filmy S1 a S2), což potvrzuje výlučnou roli Mac-1 v tomto procesu. Účinky inhibice Mac-1 na lokomoce PMN jsou dále zvýrazněny v časosběrných obrazových sekvencích (obrázek 2d) a na trajektoriích přemístění šesti reprezentativních PMN (obrázek 2e). Rychlost plazení PMN se pohybovala od 3 do 7 μm min-1 a významně se nelišila na nestimulovaných a IFNγ stimulovaných IEC (doplňkový obrázek S3B).

Adheze PMN k apikální epiteliální membráně zhoršuje funkci epiteliální bariéry

Dále jsme zkoumali vliv interakcí PMN s apikálně exprimovanými epiteliálními ligandy na funkci epiteliální bariéry. V těchto experimentech byly PMN přidány apikálně ke konfluentním T84 IEC kultivovaným na propustných nosičích (velikost pórů 0,4 μm, příliš malá na to, aby umožnila PMN TEM) a TER, jako index epiteliální bariéry, byl měřen po dobu 12 hodin za stanovených podmínek. Časový úsek 12 h byl zvolen proto, aby se zabránilo účinkům apoptotických PMN na epiteliální bariéru.29 adheze PMN stimulovaná fMLF (100 nM) k T84 IECs vyvolala časově závislý pokles TER během 12 h (∼60 %, obr. 3a). Důležité je, že přidání PMN k apikální membráně T84 IECs, které byly předem ošetřeny IFNγ, což, jak jsme ukázali, vede ke zvýšené adhezi PMN závislé na ICAM-1 (obr. 1a), vedlo k dalšímu poklesu TER (∼40 % první 2 h a ∼90 % za 12 h). Samotná léčba IFNγ neměla na TER žádný vliv. Abychom otestovali, zda pozorované zvýšení epiteliální permeability bylo způsobeno přímým kontaktem mezi epiteliálními buňkami a PMN, použili jsme anti-Mac-1 inhibiční Ab (CBRM1/29, 20 μg ml-1) k inhibici adheze PMN k IEC stimulovaným IFNγ. V tomto případě jsme použili anti-Mac-1 inhibiční Ab. Inhibice Mac-1 významně zmírnila pokles TER vyvolaný PMN po stimulaci IFNγ (obr. 3a). Důležité je, že v samostatných experimentech jsme dále potvrdili, že PMN indukované snížení TER v nestimulovaných i IFNγ ošetřených epiteliálních monovrstvách závisí na přímém kontaktu mezi PMN a apikální epiteliální membránou a není zprostředkováno parakrinními mechanismy. V těchto experimentech byly PMN přidány do spodní komory transwellů obsahujících obrácené (apikální stranou dolů) monovrstvy T84 a stimulovány fMLF (100 nM). Za těchto podmínek nebyl zjištěn žádný účinek PMN na epiteliální bariéru hodnocenou pomocí TER (obrázek 3b). Vystavení epiteliálních monovrstev 100 nM fMLF po dobu 12 hodin nemělo žádný významný vliv na TER.

Ligace epiteliálního ICAM-1 vyvolává zvýšení permeability střevního epitelu závislé na MLCK

Pozorovali jsme, že apikální upregulace ICAM-1 významně zesiluje účinky adheze PMN závislé na Mac-1 na epiteliální bariéru (Obrázek 3a). Předpokládali jsme tedy, že zvýšení permeability epiteliálních monovrstev ošetřených IFNγ vyvolané PMN bylo způsobeno shlukováním ICAM-1 zprostředkovaným kontaktem PMN a indukcí signálních dějů závislých na ICAM-1, jak bylo dříve popsáno u cévního endotelu.30, 31 Monovrstvy T84 IEC na propustných nosičích byly ošetřeny IFNγ, aby se indukovala exprese ICAM-1, a poté byly přidány zesíťované Abs na ICAM-1. Potvrdili jsme, že zesíťování pomocí Ab vyvolalo shlukování ICAM-1 (doplňkový obrázek S2C). Jak ukazuje obrázek 4a, zesíťování ICAM-1 pomocí Ab vedlo ke snížení TER v závislosti na čase, což korelovalo se zvýšeným paracelulárním tokem fluorescein-izothiokyanátu (FITC)-dextranu (3 kDa, obrázek 4b). Tento účinek byl specifický pro ICAM-1, protože zesíťování dalších povrchových molekul epitelu, hlavního histokompatibilního komplexu-1 (MHC-1; obrázek 4) a známého ligandu PMN, CD55 (doplňkový obrázek S5), nemělo na propustnost žádný významný vliv. V souladu s absencí exprese ICAM-1 na nestimulovaných IEC T84 neměla aplikace zesíťujících Abs na apikální povrch těchto IEC bez stimulace IFNγ žádný vliv na TER (doplňkový obrázek S4A). Podobně, v souladu s lokalizací ICAM-1 vyvolanou IFNγ na apikální membráně epitelu, neměla aplikace zesíťujících Abs na bazolaterální stranu epiteliálních monovrstev žádný významný vliv na bariérovou funkci (doplňkový obrázek S4B).

Již dříve jsme ukázali, že časné události v TEM PMN (na úrovni bazolaterální epiteliální membrány) vyvolávají snížení TER zprostředkované MLCK9. Bylo prokázáno, že MLCK hraje klíčovou roli v regulaci epiteliální permeability tím, že reguluje kontrakci perijunkčního aktomyozinového prstence prostřednictvím fosforylace regulačního lehkého řetězce myozinu II.32 Položili jsme si proto otázku, zda je zvýšená permeabilita IEC po ligování apikálně exprimovaného ICAM-1 závislá na MLCK. Síťování ICAM-1 pomocí Ab skutečně vedlo k fosforylaci MLCK (Tyr 464), což odpovídá aktivaci MLCK (obr. 4c). Tato aktivace byla doprovázena snížením apikálního kartáčku a perijunkčního F-aktinu (obr. 4d), což svědčí o reorganizaci aktinového cytoskeletu. Důležité je, že inhibice fosforylace MLCK vyvolané ligací ICAM-1 v buňkách T84 pomocí ML-7 (20 μM,33 doplňkový obrázek S4C) zabránila reorganizaci F-aktinu vyvolané ICAM-1 (obrázek 4d), snížení TER (obrázek 4a) a zvýšení paracelulárního toku dextranu (obrázek 4b). Samotná léčba ML-7 (20 μM) neměla na TER žádný vliv. Tyto údaje společně naznačují, že za zánětlivých podmínek kontakt PMN s apikálním povrchem epiteliálních buněk krypty spouští signální děje závislé na ICAM-1, což vede ke zvýšené permeabilitě.

Zapojení ICAM-1 na apikální membráně epitelu usnadňuje zvýšenou TEM PMN

Když ligace apikálně exprimovaného ICAM-1 zvýšila propustnost epitelu, provedli jsme experimenty s cílem zjistit, zda změny funkce epitelové bariéry závislé na ICAM-1 povedou ke zvýšené TEM PMN. Nejprve jsme zkoumali, zda zapojení PMN do ICAM-1 na apikální membráně IEC ovlivňuje TEM PMN ve fyziologicky relevantním směru od bazolaterální k apikální membráně.34 V těchto experimentech byly PMN stimulovány k migraci přes epiteliální monovrstvy a transmigrované buňky byly odebrány a znovu aplikovány po dobu 1 h na apikální povrch nových epiteliálních monovrstev (2,5 × 105 PMN na monovrstvu) s předběžnou úpravou IFNγ nebo bez ní. Po 1 hodině kontaktu PMN a epitelu byly monovrstvy promyty bez adherujících PMN a použity pro následné testy TEM PMN ve směru bazolaterální-apikální. Apikální zavedení PMN do epiteliálních monovrstev ošetřených IFNγ, ale ne do neošetřených, vyvolalo významné zvýšení TEM PMN (1,7krát, obrázek 5a). Samotné ošetření IFNγ nebo přítomnost PMN v blízkosti apikálního povrchu, ale bez přímého kontaktu s monovrstvami, nemělo na TEM PMN žádný vliv (obr. 5a). V paralelních experimentech byla TEM PMN zkoumána po specifickém zesíťování ICAM-1 pomocí Ab. V souladu s účinkem zesíťování ICAM-1 na bariérovou funkci IEC, zesíťování ICAM-1 pomocí Ab na T84 IEC ošetřených IFNγ významně zvýšilo TEM PMN (1,9±násobně, obrázek 5b) ve srovnání se zesíťováním apikálně exprimované kontrolní molekuly, MHC-1. Podle očekávání neměla aplikace protokolů zesíťování ICAM-1 na neošetřené monovrstvy IEC žádný významný vliv na TEM PMN. Tato zjištění společně naznačují, že PMN adherující k apikální (luminální) membráně IEC prostřednictvím zapojení ICAM-1 mohou vyvolat změny ve funkci epiteliální bariéry a přispět k regulaci náboru PMN.

Síťování ICAM-1 vedlo k aktivaci MLCK, což naznačuje aktin-myozinovou kontrakci (obr. 4). Proto jsme dále zkoumali účinky inhibice MLCK a inhibice F-aktinových kontraktilních sil na TEM PMN po zesíťování ICAM-1. Zvýšení TEM PMN vyvolané zesíťováním ICAM-1 bylo zvráceno, když byly IEC předem ošetřeny buď inhibitorem MLCK ML-7 (20 μM, 1 h33), nebo inhibitorem myozinového motoru II, blebbistatinem (10 μM, 1 h,35 obr. 5c). Tato zjištění naznačují roli aktomyozinové kontrakce za ICAM-1 v regulaci TEM PMN. Léčba samotným ML-7 nebo Blebbistatinem neměla na TEM PMN žádný vliv (obrázek 5c).

Ab-mediovaná ligace ICAM-1 v myším střevním lumen vede k MLCK-dependentnímu zvýšení epiteliální permeability a zvýšenému náboru PMN

Dále jsme provedli in-vivo experimenty, abychom prozkoumali vliv ligace ICAM-1 na funkci střevní epiteliální bariéry a nábor PMN s použitím modelu myší střevní kličky (obrázek 6b). V tomto modelu byla hodnocena propustnost intaktních, krví perfundovaných segmentů tenkého střeva po zavedení FITC-dextranu do střevního lumen. Jak ukazuje obrázek 6a, ačkoli ICAM-1 nebyl detekován v nestimulovaném epitelu (horní panel), intraperitoneální (i.p.) podání IFNγ a TNFα (500 ng, 24 h) vedlo k silné indukci exprese ICAM-1. Indukovaný ICAM-1 se lokalizoval zejména v apikálních oblastech myších krypt IEC nad Claudinem-2 (obr. 6a, spodní panel). Současně jsme pozorovali, že léčba cytokiny vedla k ∼2násobnému zvýšení propustnosti 3-kDa FITC-dextranu (obr. 6c).

Důležité je, že zavedení ICAM zesíťujících Abs, ale nikoli Abs na kontrolní protein MHC-1 do lumen cytokiny stimulovaných střevních kliček vyvolalo další ∼1,5násobné zvýšení propustnosti pro dextran ve srovnání s léčbou samotnými cytokiny (Obrázek 6c). Abychom potvrdili, že zvýšení propustnosti střevního epitelu je zprostředkováno specificky epiteliálními signálními událostmi vyvolanými ICAM-1, použili jsme peptidy odvozené z cytoplazmatické domény ICAM-1 (peptid ICAM-1) k inhibici schopnosti ICAM-1 zprostředkovávat následné signální události. Již dříve bylo u cévního endotelu prokázáno, že ICAM-1, ale nikoli kontrolní peptid, inhibuje interakce mezi ICAM-1 a cílovými proteiny, čímž zabraňuje signalizaci závislé na ICAM-1, aniž by ovlivnil vazbu na extracelulární ligandy leukocytů.22, 24 Přidání ICAM-1, ale nikoli kontrolního peptidu (100 μg ml-1, 30 min), inhibovalo zvýšení střevní permeability vyvolané ligací ICAM-1 (obr. 6c). Bylo potvrzeno, že abs vnesené intraluminálně do střevních kliček (nestimulované a po aktivaci IFNγ/TNFα) neprocházejí epitelem, čímž byl vyloučen možný nepřímý podíl buněk lamina propria na pozorovaných účincích (doplňkový obrázek S6).

Na další podporu role MLCK v signalizaci zprostředkované ICAM-1 byla inhibice aktivace MLCK pomocí ML-7 (1 mg kg-1, i.p.36) před zesíťováním ICAM-1 zabránila zvýšení propustnosti (obr. 6c). Tato data ukazují, že zvýšená permeabilita střevního epitelu in vivo po podvázání ICAM-1 je závislá na MLCK.

Jelikož je zvýšená permeabilita epitelu spojena se zvýšenou migrací PMN, položili jsme si otázku, zda podvázání ICAM-1 povede ke zvýšenému náboru PMN in vivo. Pomocí modelu myší střevní kličky byla infiltrace PMN do střevní sliznice a migrace do lumen vyvolána luminálním podáním chemoatraktantu CXCL1 (1 μM ve 200 μl Hankova vyváženého solného roztoku (HBSS)+) a kvantifikována pomocí imunofluorescenčního značení/konfokální mikroskopie a analýzy vyplavené tekutiny připravené na cytospinech, resp. obarvené pomocí Diff-Quik. V nepřítomnosti chemoatraktantu nebyly PMN ve střevním epitelu ani ve střevním lumen detekovány (není uvedeno); luminální podání CXCL1 však vyvolalo významnou migraci PMN do epiteliální vrstvy (obr. 7a) a jejich akumulaci ve střevním lumen (obr. 7c). V souladu s cytokiny indukovaným zvýšením permeability zvýšila léčba IFNγ/TNFα ∼2,2krát počet PMN ve střevním epitelu a ∼1,7krát v lumen. Důležité je, že přídavek ICAM-1 zesíťujícího Abs do lumen střevních kliček ošetřených cytokiny dále zvýšil (oproti léčbě samotnými cytokiny) počet PMN jak v epitelu (∼1,6násobně, obr. 7a,b), tak v lumen (∼1,4násobně, obr. 7c,d). PMN (zeleně) infiltrující střevní epitel (červeně) jsou zobrazeny na reprezentativních snímcích tkáňových řezů ze střevních kliček aktivovaných cytokiny po ligaci ICAM-1 (obrázek 7b). Podobně jsou PMN, které migrovaly do lumen po ligaci ICAM-1, zobrazeny na reprezentativních snímcích výplachových tekutin ze střevních kliček (obrázek 7d).

V souladu se zvýšením propustnosti epitelu vyvolaným ligací ICAM-1 byla zvýšená migrace PMN do střevního lumen závislá na signálních událostech zprostředkovaných ICAM-1 a aktivaci MLCK. Jak intraluminální přidání peptidu ICAM-1, ale nikoli kontrolního peptidu (není uvedeno; 100 μg ml-1, 30 min), tak inhibice MLCK (ML-7, 1 mg kg-1, i.p.) před zesíťováním ICAM-1 pomocí Ab zcela inhibovaly zvýšení migrace PMN vyvolané ligací ICAM-1 (obr. 7a,c). Tato zjištění naznačují, že zapojení ICAM-1 na apikální membráně střevního epitelu v podmínkách zánětu narušuje bariérovou funkci, a tím usnadňuje zvýšený nábor PMN in vivo.