Deuterated Chloroform
13.4.4.4 Vurdering og vedligeholdelse af instrumentets ydeevne
Indarbejdelse af laboratorieinstrumenter i kvalitetsstyringssystemer, der anvendes til laboratoriecertificeringer (dvs. ISO17025 for analyselaboratorier), kræver vurdering og vedligeholdelse af instrumentets ydeevne med regelmæssige intervaller. Disse certificeringer gør det muligt for laboratorieanalytikeren at udarbejde test for driftskvalifikation (OQ) og præstationskvalifikation (PQ) omkring den tilsigtede anvendelse af instrumentet. For NMR kan OQ/PQ-testene således variere afhængigt af de almindelige analytiske test, der skal udføres på instrumentet. Moderne instrumenter har automatiske procedurer, som kræver, at brugeren indsætter den relevante prøve, hvorefter en række test udføres på en automatiseret måde. Ved afslutningen af disse test udstedes en rapport, som giver brugeren mulighed for at vurdere spektrometerets samlede ydeevne.
Til testning af proteinterapeutika i vandige opløsninger bør disse OQ-tests omfatte: temperaturkalibrering, linjeform på acetonsignalet i deutereret kloroform, følsomhed på ethylbenzensignaler i deutereret kloroform og/eller vandundertrykkelse med følsomhedsvurdering på de anomeriske protoner i en 2 mM saccharoseopløsning. Temperaturkalibrering er vigtig, fordi et proteins dynamik påvirkes af de omgivende opløsningsbetingelser, hvilket kan have store virkninger på de observerede signallinjebredder og -frekvenser. Regulering af prøvetemperaturen i NMR-spektrometre er afhængig af omhyggelig kontrol af sondens lufttemperatur og flowhastighed. Sondeluftens indvirkning på prøvens temperatur kan måles ved at måle de kemiske forskydninger i en 100 % methanol- eller 100 % ethylenglycolopløsning. Disse forskydninger er blevet målt omhyggeligt, således at den faktiske prøvetemperatur kan vurderes med en given indstilling af sondelufttemperatur og flowhastighed.
Den betydning, det har for spektralkvaliteten at have en god prøveafskærmning (dvs. et ensartet magnetfelt over den observerede del af en prøve), kan ikke overvurderes: jo smallere toppe, jo bedre opløsning og følsomhed af de signaler, der kan måles. Hvis der anvendes teknikker til signalundertrykkelse, gælder det, at jo smallere basen af den top, der skal undertrykkes, jo bedre vil teknikkerne til forsmætning eller selektiv signalundertrykkelse i smalle bånd fungere. Heldigvis har fremkomsten af field-mapping-teknikker og gradient shimming forenklet denne ofte tidskrævende opgave med at justere shim-indstillingerne for hver enkelt prøve. Der vil imidlertid være prøver, for hvilke shim-maps ikke fungerer godt, og der skal bruges tid på shim-justering for at få optimal respons fra instrumentet.
Evaluering af spektrometerets følsomhed med standardprøver er en ideel måde at følge systemets ydeevne på, og de værdier, der opnås ved standardprøverne, skal opfylde eller overskride de spektrometerspecifikationer, der er fastsat af producenten. Det skal bemærkes, at spektrometerspecifikationerne ofte er fastsat på en konservativ måde af fabrikanten for at sikre, at deres instrument består disse test ved installationen. Ved at udføre OQ/PQ-testene med regelmæssige mellemrum kan ejeren af spektrometeret imidlertid blive fortrolig med det pågældende instruments kapacitet. Afvigelser fra det sæt værdier, der er fastlagt ved rutinemæssig testning, bør undersøges nøje, da de kan være tegn på fejlfunktion i instrumentet.
Ved analyse af små molekyler i organiske opløsningsmidler fører brugen af acetonsignalet i deutereret kloroform for at opnå ikke blot en lorentzisk linjeform og en smal FWHH, men også en smal base (f.eks. <20 Hz ved 20% af 13C-satellitsignalet) normalt til den bedste følsomhed for ethylbenzen-signaler i deutereret kloroform. For spektrometre, der anvendes til at opnå spektrer i vandige opløsninger, er en anden følsomhedsmåling vigtigere: spektrometerets evne til at opnå god følsomhed og opløsning af signaler nær vandtoppen. Således er måling af følsomheden med de anomeriske protonsignaler fra en standard bestående af 2 mM saccharose i 95% H2O/5% D2O-opløsning med anvendt vandundertrykkelse et mere realistisk mål for spektrometrets signal/støj-ydelse til NMR af proteinterapeutiske prøver.
For en PQ på et spektrometer, der vurderer kvaliteten af proteinterapeutiske lægemidler, er en kritisk kvalitetsegenskab for disse lægemidler en specifik tertiær struktur, der er givet ved foldningen af aminosyre-kæden. Som en PQ på et spektrometer, der udfører 2D-strukturkortanalyse, kan 2D-HSQC-spektrer derfor køres på kort tid på en 15N- eller 13C-isotopisk beriget prøve for at fastslå spektrometerets evne til at udføre pulsprogrammer med effektive afkoblingsordninger og gradientkohærensvalg. 13C- eller 15N-isotopisk berigede protein- (f.eks. SH3-domæneprotein eller ubiquitin) standardopløsninger i forseglede rør er kommercielt tilgængelige i koncentrationer, der gør det muligt at indsamle data på få timer. Passende kalibrerede spektrometre ved 500 MHz og derover og udstyret med en kryosonde kan måle 2D-strukturkort på proteiner med naturlig overflod (dvs. ikke isotopisk beriget) ved en koncentration på ∼1,0 mM på 2-3 dages spektrometertid.