PMC
DISCUSSION
Den DNA-syntesen model system indeholder alle de proteiner, der er nødvendige for at støtte hver fase af DNA-replikationsprocessen, og disse proteiner spænder i størrelse fra 20 til 240 kDa under de nuværende testbetingelser, og kan udføre alle faser af DNA-replikationsprocessen in vitro. I denne undersøgelse blev den syntesesimens-associerede DNA-primaseaktivitet karakteriseret ved at undersøge syntesen og forlængelsen af RNA-primere, der katalyseres in vitro af DNA-syntesen. Resultaterne af vores funktionelle analyser viser, at den synthesome-associerede DNA-primaseaktivitet i P4-fraktionen, der stammer fra brystkræftceller, er 30 gange højere end i rå brystkræftcelleekstrakter. P4-fraktionen, der indeholder DNA-syntesen, blev afledt af de kombinerede nukleare og cytoplasmatiske opløselige proteinfraktioner fremstillet fra MCF7-celler og blev anvendt til at udføre SV40 in vitro DNA-replikeringstest . Aktiviteterne af DNA-polymerase α og δ og DNA-primase i P4-fraktionen er 20-40 gange højere end i råcelleekstrakter ; hvilket gør den til et nyttigt redskab til disse undersøgelser, fordi den er fuldt kompetent til at understøtte syntese og forlængelse af RNA-primere i et in vitro-modelsystem, der har vist sig at understøtte alle faser af DNA-replikationsprocessen .
DNA-primase udviser en unik processivitet i syntese og forlængelse af RNA-primere. Denne processivitet er defineret af en konkurrence mellem tilføjelsen af det næste korrekte nukleotid og dissociation af primer-skabelon-komplekset . DNA-primase er det eneste enzym, der er i stand til at syntetisere RNA-primere under igangsættelsen af DNA-syntesen . Ingen af de enkelte primaseunderenheder er i stand til at syntetisere eller forlænge en RNA-præmmer på egen hånd . Syntesen indeholder begge primaseunderenheder (dvs. p49 og p58) og kan katalysere syntesen af RNA-primere in vitro ved hjælp af en eksogen poly(dT)-template. Syntesen-syntesen syntetiserer en funktionel RNA-primer af enhedslængde (7-10 nt). Disse RNA-primere hydrolyseres fuldstændigt af RNase til korte fragmenter på 1-4 bp, men de hydrolyseres ikke af DNase. Det kendetegnende træk ved den synteseassocierede primase, som adskiller den fra en isoleret DNA-primase, er dens specifikke evne til at forlænge RNA-primeren for at danne en DNA-primer-streng. Syntesen af en DNA-primerstreng kræver også DNA-polymeraseaktivitet ud over DNA-primaseaktivitet. DNA-polymeraseaktiviteten skiftes normalt til at starte forlængelsen af en RNA-primer efter syntesen af primeren. Kun RNA-primere ≥7 nukleotider lange udnyttes af polymerasen; uanset dNTP-koncentrationen . Syntesen og forlængelsen af enhedslængde RNA-primer kræver således ikke kun primase, men involverer også DNA-polymerase α-underenheden p180 , og syntesen indeholder meget aktive DNA-polymeraser, som katalyserer inkorporeringen af deoxyribonukleotider for at forlænge RNA-primeren. RNA-præmier forlænges af de til syntesesimsen knyttede polymeraser fra en DNA-RNA-oligoprimer med en længde på 20-40 nt (DNA-præmier). DNA-primerstrenge indeholder to komponenter: (1) et ribonukleotid på 10 nt og (2) et deoxyribonukleotid på 20-40 nt. RNase og DNase hydrolyserer hver for sig de relevante komponenter i DNA-primerstrengene, hvilket resulterer i en forkortelse, men ufuldstændig hydrolyse af DNA-primerstrengen.
Et andet kendetegn ved syntesen er den hurtige syntese og de forskellige størrelser af RNA-primer- og DNA-primerstrengen. Syntesen katalyserer hurtigt syntesen af både en RNA-primer og en DNA-primer-streng, og steady-state-niveauer synes at akkumuleres inden for (5-15 min). Størrelsen af RNA-primeren (7-10 nt) og DNA-primer-strengen (20-40 nt), som katalyseres af DNA-syntesen, er altid konstant, uanset syntesens koncentration eller reaktionstid. Denne undersøgelse af DNA-primaseaktivitetens mekanisme antyder, at syntesen af RNA-primere, der katalyseres af den tilknyttede primase, sker via en langsom initiering, hurtig polymerisering og “intelligent” afslutning af primeren . DNA-primase binder DNA-skabelonen og indleder langsomt syntesen af et dinukleotid. Efter syntesen af dinukleotidet tilføjes der hurtigt yderligere NTP’er til det dinukleotid, der er polymeriseret af DNA-primase. DNA-primaseaktiviteten er kendetegnet ved, at hver enkelt RNA-primer syntetiseres i et enkelt “burst” af aktivitet, snarere end via distributiv syntese . Når der er blevet dannet enhedslængdeprimere på 7-10 nt, fungerer primase-templet som et termineringssignal og hæmmer yderligere RNA-syntese. Denne hæmning skyldes dannelsen af en stabil primer-template, som sandsynligvis forbliver associeret med pol α-primase-komplekset. Interessant nok ligner de DNA-primerstrenge, der syntetiseres af DNA-syntesen in vitro, de syntesen-katalyserede RNA-primere, der syntetiseres in vitro. Syntesen af en DNA-primerstreng når hurtigt steady state-niveauer, og størrelsen af DNA-primerstrengen forbliver relativt konstant (mellem 20 og 40 nt), uanset reaktionstiden eller koncentrationen af den anvendte syntese i løbet af syntesereaktionen. DNA-primer-strengsyntese kræver DNA-polymerase α-aktivitet ud over DNA-primase . Vores resultater tyder på, at den syntese-associerede polymerase α-aktivitet også er karakteriseret ved en hurtig polymerisering og “intelligent” afslutning i syntesen af DNA-primerstrengen. Syntesen, med egenskab af hurtig polymerisation og intelligent DNA-primerstrangterminering, adskiller sig fra syntesen medicineret af Klenow-fragmentet af E. coli DNA-polymerase I under forlængelsen af RNA-primeren. I modsætning til syntesen afhænger RNA-primerforlængelsen, der katalyseres af polymerase I, stærkt af reaktionstidens længde. En forøgelse af reaktionstiden øger mængden og størrelsen af de forlængede RNA-primere betydeligt.
To potentielle mekanismer er blevet foreslået for at forklare skiftet fra primersyntese til primerforlængelse under DNA-replikationsprocessen . Den første foreslår, at primase-polymerase-komplekset dissocieres fra primer-skabelonen og genforenes med det aktive sted for polymerase. Det andet forslag går ud på, at skiftet sker ved en intrastrand-translokation af pol α-primase-komplekset fra det aktive primasested til det aktive sted for polymerase α. Dette skift indebærer ikke dissociation af pol α-primase-komplekset fra DNA-templaten. Vores eksperimenter viser, at polymerase I-katalyseret RNA-primerforlængelse hæmmes af høje koncentrationer af DNA-syntesen. Klenow-fragmentets evne til at forlænge en RNA-primer afhænger af den syntese af RNA-primere, der katalyseres af syntesen, som også har brug for et tilgængeligt bindingssted ved RNA-primerens terminus. Derfor kræver Klenow-fragmentet af E. coli polymerase I, at primase-polymerase-komplekset dissocieres fra primer-templatet. Høje koncentrationer af syntesen konkurrerer imidlertid med polymerase I om bindingsstedet på primer-skabelonen, således at forlængelsen af RNA-primeren hæmmes. Syntesen danner et dødt kompleks ved RNA-primerens terminus, hvilket medfører, at Klenow-fragmentet ikke er i stand til at deltage i RNA-primerens forlængelsesproces. Dette resultat tyder på, at DNA-syntesens polymerase-primase-kompleks må dissocieres fra primer-templatet efter syntesen af RNA-primeren. Vores resultat viser, at syntesen øger størrelsen af enhedslængden af RNA-præmmeren, når reaktionstemperaturen sænkes. Ved at sænke reaktionstemperaturen øges effektiviteten af skiftet mellem polymerase-primase-komplekset og mindskes denatureringen af primer-template . Desuden indeholder DNA-primase p49-underenheden den katalytiske RNA-polymeraseaktivitet, som er nødvendig for at øge størrelsen af RNA-primereenhedens længdeenhed . Derfor tyder vores resultater på, at DNA-syntesen har den relevante RNA-polymeraseaktivitet, der er nødvendig for at danne RNA-primerede DNA-fragmenter.
Den kinetiske analyse af RNA-primerinitiering og -forlængelse viser, at syntesen associeret DNA-primase er et langsomt og relativt svagt enzym med hensyn til template-binding . DNA-primase er også en fejlbehæftet nukleinsyrepolymerase, fordi dette enzym har en meget dårlig evne til at skelne mellem nukleotider, hvilket resulterer i fejlinkorporering af nukleotider . Derfor kan vores analyse af den enzymatiske kinetik af den synteseforbundne DNA-primaseaktivitet bruges til at bestemme forholdet mellem syntetiske hastigheder og fejlfrekvenser under syntesen af RNA-primere. Den diskontinuerlige syntese af DNA-fragmenter (Okazaki) på replikationsgafflens efterslæbende streng er en vigtig biokemisk proces under DNA-replikation. For at sikre en effektiv koordinering mellem den kontinuerlige syntese af DNA på den forreste streng og den diskontinuerlige syntese af DNA på den bageste streng kræver DNA-primase en række præcist timede enzymatiske trin, der styrer syntesen af RNA-primeren. En kinetisk undersøgelse af et multiproteinreplikationskompleks fra bakteriofagen T7 viser, at primasen fungerer som en molekylær bremse og midlertidigt standser replikationsgaflens progression . På grund af den fysiske interaktion mellem DNA-polymerase δ og pol α tyder det resultat, som Lee et al. præsenterer, på, at DNA-primase kan være i stand til at forhindre, at syntesen af den ledende streng overhaler syntesen af den bagvedliggende streng under de langsomme enzymatiske trin på den bagvedliggende streng.
Der er blevet anvendt forskellige eukaryote DNA-replikationsmodeller til undersøgelse af DNA-primasefunktionen. Det nukleare matrixreplikationssystem af hele cellelysat er blevet anvendt til at undersøge syntesen og fordelingen af native RNA-primer og RNA-primeret nascent DNA i eukaryote cellekerner ved hjælp af endogene nukleare matrix-bundne dobbeltstrengede DNA-skabeloner . RNA-primere er tæt forbundet med kernematrixen i hurtigt prolifererende pattedyrceller . RNA-primere er kovalent knyttet til nyligt replikeret DNA for at danne RNA-primeret nascent DNA. RNA-primeret DNA nedbrydes til nogle oligoribonukleotider med en længde på ~10 nt efter DNasefordøjelse , og mindst 94 % af de native RNA-primere og RNA-primeret nascent DNA befinder sig inden for den uopløselige matrixfraktion af kernen. RNA-primere med en længde på 8-10 nt, som findes i forbindelse med kernematrixen, udgør <1% af det samlede RNA i cellen, hvilket gør det meget vanskeligt at undersøge RNA-primere og RNA-primet nascent DNA i cellens kernematrixfraktion på grund af den meget lave koncentration af RNA-primere og den relativt store mængde af andet RNA. Desuden er isolering af RNA-primere og RNA-primeret nascent DNA fra radionukleotidmærkning af hele cellelysater en kompliceret og ikke-triviel oprensningsprocedure, når den anvendes til analyse af RNA-primersyntese efter kernematrix-replikationsmodellen, der er medieret af RNA-primere. I modsætning hertil indeholder den DNA-syntese, der er oprenset fra de kombinerede nukleare og cytoplasmatiske fraktioner, meget aktiv DNA-primase og DNA-polymeraser og understøtter fuldt ud syntesen af native RNA-primere in vitro ved hjælp af en dobbeltstrenget SV40-oprindelse indeholdende en DNA-template. De DNA-syntese-syntetiserede RNA-primere er af normal længde (10-20 nukleotider) og synes at fungere korrekt til at understøtte primerforlængelse med DNA-polymerase. Disse RNA-primere kan let forlænges til at danne RNA-primeret nascent DNA på 100-200 nt. Den diskontinuerlige syntese af DNA-fragmenter (Okazaki) på replikationsgafflens efterslæbende streng er en vigtig biokemisk proces, der er involveret i DNA-replikation, og DNA-fragmenter (Okazaki) af fuld længde, der syntetiseres af DNA-syntesen, er også omkring 100-200 nukleotider lange. Vi observerede, at DNA-syntesen kunne syntetisere forskellige RNA-primede produkter, der varierer i størrelse fra 10 til 200 nt i længde. Dette kan betragtes som rimeligt, da native RNA-primere og RNA-primeret nascent DNA også er af denne omtrentlige længde. Ovenstående observation, at syntesen af RNA-primer og RNA-primeret nascent DNA, katalyseret af DNA-syntesen, i det væsentlige svarer til den undersøgelse, der er offentliggjort ved hjælp af kernematrixreplikationsmodellen af helcellelysat , tyder på, at DNA-syntesen er et fremragende modelsystem, der er i stand til at udføre en fysiologisk meningsfuld DNA-replikationsproces in vitro.
DNA-syntesemodellen er derfor et unikt og værdifuldt redskab i studiet af DNA-primasefunktion. Primaseformidlet syntese og forlængelse af RNA-primersyntese og -forlængelse udført af DNA-syntesen ligner nøje det, der udføres af andre cellefrie replikationsmodeller. Syntesemodellen understøtter syntese og forlængelse af RNA-primere in vitro ved hjælp af eksogene enkeltstrengede DNA-skabeloner samt superoprullet dobbeltstrenget DNA, der indeholder en intakt SV40-replikationsoprindelse. Derfor er DNA-syntesen fuldt ud i stand til at formidle syntesen og forlængelsen af RNA-primere in vitro og kan lette den videre undersøgelse af de mekanismer, der initierer DNA-syntesen i eukaryote celler. Tilsammen tyder vores resultater på, at synthesome-modellen giver et unikt værktøj til at studere interaktionen mellem DNA-primase og andre replikationsproteiner under DNA-replikationsprocessen.