Produktion af humant albumin hos svin gennem CRISPR/Cas9-Mediated Knockin of Human cDNA into Swine Albumin Locus in the Zygotes
Human serumalbumin (HSA) er det mest rigelige plasmaprotein, der spiller kritiske homeostatiske funktioner i menneskets fysiologi, herunder opretholdelse af det onkotiske tryk i plasma, regulering af fordelingen af kropsvæsker, transport af små molekyler osv.1. Det ordineres til en række alvorlige sygdomme som f.eks. leversvigt og traumatisk chok2. På grund af manglen på humant blod og de risici, der er forbundet med humant blod, har man længe søgt at finde alternative metoder til fremstilling af humant albumin. Rekombinant HSA-produktion er tidligere blevet forsøgt i svin gennem dominant transgenekspression i form af albumin-GFP-fusion3. I transgene metoder er det imidlertid problematisk at separere og rense rHSA på grund af tilstedeværelsen af endogent svinealbumin i svinealbumin. Ved at udnytte CRISPR/Cas9-systemets muligheder for genommodifikation forsøgte vi at producere rHSA i svin ved at banke humant albumin-cDNA ind i svinealbumin-lokus. Ved at indsætte det humane ALB-cDNA plus SV40 polyA-signalsekvensen (i alt 2368 bp) i svine-albumin-lokus umiddelbart nedstrøms startkodonet forventer vi, at humant ALB vil blive udtrykt under svine-endogent albumin-transkriptionskontrol og samtidig blokere ekspressionen af svine-endogent albumin (fig. 1a). Vi designede et sgRNA, der var rettet mod startkodonregionen (umiddelbart 5′ fra og inklusive ATG) og genererede et målfragment (donor for homolog rekombination) med indsatsen flankeret af 1 kb homologisekvenser på begge sider (fig. 1a). Da den 5′-homologisekvens, der er anvendt i donoren, løber op til startkodonet, indeholder den sgRNA-sekvensen og kan således målrettes af sgRNA’et som donor eller af knockin-allelen efter homolog rekombination. For at forhindre, at dette sker, indsatte vi 6 bp (gccacc) i sgRNA-sekvensen lige før startkodonet. sgRNA’et blev transskriberet in vitro, oprenset og injiceret i de befrugtede oocytter sammen med Cas9 mRNA4 og den cirkulære vektor, der indeholder det målrettede fragment. Kilden til oocytter var Bama-minipig5. De injicerede embryoner blev dyrket i 1-2 timer, inden de blev implanteret i brunstsynkroniserede hunner. Der blev implanteret ~300 embryoner i 10 hunner, hvoraf 5 blev drægtige og fødte i alt 16 levende hvalpe. Hvalpene var under standardpleje og viste ingen tegn på usædvanlige sundhedsproblemer.
Knockin af human ALB til svine Alb locus.
(a) Diagram over knockin-strategien. (b) Genotypebestemmelse af grundlæggerne. PRC-primere er illustreret i (a). (c) Sekvenseringsresultater af de PCR-produkter, der er opnået med primerpar e/f (a). Produkterne blev klonet, og op til 12 kloner (for #9) blev sekventeret.
Vi klippede ørespidserne af de 16 smågrise, da de var ca. 4 uger gamle, og udtog genomisk DNA til genotypebestemmelse. For at afgøre, om det var lykkedes os at knockinere, vurderede vi både 5′- og 3′-enden af indsættelsesstedet. Vi anvendte to primerpar, a/b og c/d (fig. 1a). Primer a er uden for den 5′-enden af den anvendte homologi, og b er på human ALB (indsættelsen); c er på human ALB og d uden for 3′-enden af homologien. Som det fremgår af fig. 1b, bærer alle 16 smågrise den tilsigtede knockin-allel. Vi klonede og sekventerede alle de amplificerede DNA-fragmenter. De var de forventede homologe rekombinationsprodukter (fig. S1). Dernæst bestemte vi status for wild-type-allelen i disse smågrise. Primere e og f (indeholdt i insertet) (Fig. 1a) skulle amplificere et 705 bp-fragment fra vildtypelokusset og et 3085 bp-fragment fra knockin-allelen. Som forventet genererede de alle sammen fragmentet på 3085 bp. Uventet kunne vi imidlertid kun opnå det tilsyneladende 705 bp wildtype-fragment fra 7 (nr. 5, 6, 9, 10, 12, 13 og 15) af de 16 prøver, mens resten genererede svage produkter omkring 700 bp (fig. 1b). Den tilsyneladende mangel på wildtypeallel hos nogle smågrise tyder på, at knockin kan være sket på begge alleler. Alternativt kan wildtypeallelen være blevet redigeret på en sådan måde, at primer a-sekvensen er blevet slettet, hvilket resulterer i, at wildtypeallelen ikke kan amplificeres. Der skete faktisk en redigering af wildtypeallelen, fordi størrelsen af de amplificerede fragmenter afveg fra de forudsagte 705 bp hos nogle smågrise (fig. 1b). For at bekræfte dette klonede og sekventerede vi alle de amplificerede fragmenter. Som vist i Fig. 1c blev de alle redigeret, selv om nogle af dem kun var nogle få basepars ændringer (derfor syntes de at være på 705 bp). Blandt disse redigerede alleler er de alleler, der blev fundet i pattegris nr. 10 og nr. 12, af interesse. Den i #10 var et produkt af udskiftning af en strækning på 29 bp (fra ATG til 3′-enden) af svinesekvensen med 36 bp (6 bp 5′ fra ATG og 26 bp derefter) af donorsekvensen. Det er uklart, hvordan dette skete. I nr. 12 er der to forskellige redigerede alleler, hvilket bringer det samlede antal alleler op på 3, hvilket tyder på mosaikisme i denne pattegris, hvilket ikke er ualmindeligt, da der ofte blev fundet mosaikisme i dyr, der er genereret ved zygoteinjektion af Cas9/sgRNA6,7,8,9,10.
For at bestemme, om der var sket off-targeting med sgRNA’et, valgte vi 4 top potentielle off-target sites baseret på forslag fra CRISPR-designværktøjet (http://tools.genome-engineering.org) og amplificerede fragmenter, der indeholdt disse sites, fra ørespidsgenomisk DNA fra pattegris nr. 14. Fragmenterne blev underkastet T4EN I-assay4. Som vist i fig. S2 blev der ikke fundet nogen off-target-redigering. Vi kunne dog ikke udelukke muligheden for, at der skete off-target-redigering i andre loci eller i de andre 15 transgene grise. Ikke desto mindre er det usandsynligt, at selv om der var off-target-redigering, vil de redigerede loci ikke være problematiske for vores formål med at producere rHSA, så længe de ikke forstyrrer velfærden hos disse transgene grise.
Når vi havde påvist en vellykket knockin af den humane ALB, forsøgte vi at bestemme, om humant albumin kunne påvises i blodplasmaet hos disse knockin-grise. Som vist i fig. 2a indeholdt alle smågrisene humant albumin i deres blodplasma, der kunne påvises med antistoffer specifikke mod humant albumin, om end i varierende mængder, hvilket sandsynligvis er et resultat af mindst to faktorer, nemlig om begge alleler er knockin og omfanget af mosaikisme (især i leveren). Niveauet i nr. 7 er meget lavt og er kun synligt efter lang eksponering af blottet, på trods af den tilsyneladende mangel på wild-type svine-Alb-allel (fig. 1a). Samlet set er niveauerne meget lavere end niveauerne i voksne menneskers sera. Det er kendt, at koncentrationen af blodalbumin hos svin stiger med alderen og når et niveau svarende til niveauet hos voksne mennesker ved 6 måneders alderen11.
Analyse af humant ALB i blodet.
(a) Western blot-detektion af humant albumin i blodet fra stiftende smågrise. 0,5 μl plasma fra hver grundlægger blev separeret på SDS-PAGE og analyseret. Plasma af humant blod (0,5 μl efter fortynding 30 gange) blev anvendt som positiv kontrol. C, plasma fra en vildtype gris. (b) Illustration af tryptiske peptider (grøn) påvist med massespektrometrisk analyse. (c) Semi-kvantitering af to tryptiske peptider fra humant og svinealbumin ved at måle peakarealerne for hvert peptid. Rødt markerer de aminosyrerester, der er specifikke for gris.
For at bekræfte, at den rHSA, der er påvist i plasmaet hos vores knockin-grise med antistoffer, virkelig er humant albumin, underkastede vi to plasmaprøver (pattegris nr. 2 og nr. 6) massespektralanalyse. #2 er tilsyneladende homozygot for knockin-allelen, og #6 indeholder en knockin- og en mutantallel (frameshift) (fig. 1). 0,5 μl plasma blev separeret på SDS-PAGE, og proteiner omkring 70 KD blev i gelet fordøjet med trypsin. De tryptiske peptider blev elueret ud af gelen, tørret og opløst igen med henblik på separation ved flydende kromatografi og massespektrometrisk analyse. For pattegris nr. 2 kunne vi påvise 14 unikke humane ALB-tryptiske peptider og 15 for nr. 6 (fig. 2b). M/Z-spektre for humant peptid FKDLGEENFK og svinepeptid FKDLGEQYFK (begge fra pattegris nr. 2) blev vist i fig. S3. To peptider blev udvalgt til kvantificering ved at måle peakarealerne. I overensstemmelse med Western Blot-resultaterne var disse to peptider meget mere (~5 gange) hyppigere i nr. 2 end i nr. 6 (fig. 2c). Disse resultater viser, at den rHSA, der påvises af antistoffer, er autentisk humant albumin.
Genotyping af DNA isoleret fra ørespidserne viser, at både nr. 2 og nr. 6 ikke indeholder nogen vildtype svine-Alb-allel, enten ikke til stede eller redigeret (fig. 1b,c). Vi kunne dog stadig påvise tryptiske peptider fra svinealbumin i begge prøver, men i langt mindre hyppighed (Fig. 2c). Det er interessant, at abundansen af svinepeptider var omtrent den samme mellem de to prøver, på trods af at abundansen af humane peptider var meget forskellig. Disse resultater tyder på, at begge smågrise indeholder et lignende antal wildtype (eller heterozygote) hepatocytter, som er ansvarlige for den svine-ALB, der er påvist i blodet fra disse to smågrise. Det er imidlertid muligt, at sådanne celler, der indeholder wildtypeallel, ikke findes eller findes i en ekstremt lav procentdel i ørespidserne, således at wildtypeallelen ikke kunne PCR-amplificeres. Endvidere viste Southern Blot-analyse med en intern sonde (3′ halvdelen af humant ALB CDS), at der var en yderligere indsættelse af donorsekvensen hos pattegris nr. 1, 4 og 5 (fig. S4). Alle disse komplikationer vil ikke være et problem med henblik på produktion af rekombinant humant albumin, da knockin-allelen kan oprenses gennem backcrossing.
For at afgøre, om knockin-allelen kan overføres til næste generation, krydsede vi nr. 2 (han, homozygot) med nr. 5 (hun, heterozygot), da de blev reproduktionsmodne. Der blev født 6 hvalpe ud af krydsningen. 4 af dem (nr. 1, 3, 4 og 6) er homozygote for knockin-allelen (AlbH/H, H betegner menneske) og 2 (nr. 2 og 5) heterozygote (AlbP/H, P betegner gris) (fig. 3a). #nr. 5 og 6 døde af diarré ca. 2 uger efter fødslen. Vi analyserede humant albuminekspression i blodet hos de resterende smågrise ved 4-ugers alderen. Som det fremgår af fig. 3b, har de alle humant albumin i deres blod. Interessant nok var niveauet af humant albumin i det heterozygote dyr (nr. 2) meget lavere end i de homozygote dyr. Vi ved ikke, om dette er et resultat af individuel variation, eller om knockin-allelen på en eller anden måde undertrykkes af wildtype-allelen.
Germlinetransmission af knockin-allelen.
(a) PCR-genotypebestemmelse af F1-afkommet. De anvendte primere var de samme som i fig. 1. (b) Western Blot-detektion af humant albumin i blodet fra F1-grisene. 0,5 μl plasma fra hver pattegris blev separeret på SDS-PAGE og analyseret. C, plasma fra et vildtypegris. M, molekylvægtmarkør.
Vi viser her den vellykkede generation af grise, der bærer humant ALB cDNA, der er banket ind i svine Alb locus. Dette er et skridt videre end den simple genredigering i svinezygoter, som Hai et al.12 og os13 for nylig har rapporteret om. Man har forsøgt at anvende store husdyr som bioreaktorer til biomedicinske proteinprodukter14,15,16,17,18,19,20. Normalt blev de kodende sekvenser af disse proteiner indsat tilfældigt sammen med de nødvendige transkriptionskontrolelementer i genomet som transgener, hvilket er forbundet med mange komplikationer, herunder kortvarig transgenekspression. Vores demonstration af, at homolog rekombination kan finde sted meget effektivt i svinezygoter, åbner døren for udvikling af stadig bedre bioreaktorer samt husdyrstammer med flere og flere ønskelige egenskaber.