Deuteriertes Chloroform
13.4.4 Bewertung und Aufrechterhaltung der Geräteleistung
Die Einbindung von Laborgeräten in Qualitätsmanagementsysteme, die für Laborzertifizierungen verwendet werden (z. B. ISO17025 für analytische Laboratorien), erfordert eine regelmäßige Bewertung und Aufrechterhaltung der Geräteleistung. Diese Zertifizierungen ermöglichen es den Analytikern im Labor, Tests zur Betriebsqualifikation (OQ) und zur Leistungsqualifikation (PQ) zu erstellen, die sich auf die beabsichtigte Verwendung des Instruments beziehen. Bei der NMR können die OQ/PQ-Prüfungen daher je nach den üblichen analytischen Tests, die mit dem Gerät durchgeführt werden sollen, unterschiedlich ausfallen. Moderne Geräte verfügen über automatische Verfahren, bei denen der Benutzer die entsprechende Probe einlegen muss, woraufhin eine Reihe von Tests automatisch durchgeführt wird. Am Ende dieser Tests wird ein Bericht erstellt, der es dem Benutzer ermöglicht, die Gesamtleistung des Spektrometers zu bewerten.
Für die Prüfung von Proteintherapeutika in wässrigen Lösungen sollten diese OQ-Tests Folgendes umfassen: Temperaturkalibrierung, Linienform des Acetonsignals in deuteriertem Chloroform, Empfindlichkeit für Ethylbenzolsignale in deuteriertem Chloroform und/oder Wasserunterdrückung mit Empfindlichkeitsbewertung für die anomeren Protonen einer 2 mM Saccharoselösung. Die Temperaturkalibrierung ist wichtig, da die Dynamik eines Proteins durch die Umgebungsbedingungen in der Lösung beeinflusst wird, was große Auswirkungen auf die beobachteten Signal-Linienbreiten und Frequenzen haben kann. Die Regulierung der Probentemperatur in NMR-Spektrometern beruht auf einer sorgfältigen Kontrolle der Temperatur und Durchflussrate der Sondenluft. Der Einfluss der Sondenluft auf die Temperatur der Probe kann durch Messung der chemischen Verschiebungen einer 100%igen Methanol- oder 100%igen Ethylenglykollösung gemessen werden. Diese Verschiebungen wurden sorgfältig gemessen, so dass die tatsächliche Probentemperatur bei einer bestimmten Einstellung von Sondenlufttemperatur und Durchflussrate bewertet werden kann.
Die Auswirkungen eines guten Proben-Shimings (d. h. eines gleichmäßigen Magnetfeldes über den beobachteten Teil einer Probe) auf die Spektralqualität können nicht hoch genug eingeschätzt werden: Je schmaler die Peaks, desto besser die Auflösung und Empfindlichkeit der zu messenden Signale. Je schmaler die Basis des zu unterdrückenden Peaks ist, desto besser funktionieren die Techniken zur Vorsättigung oder zur selektiven Unterdrückung von Schmalband-Signalen. Glücklicherweise hat das Aufkommen von Field-Mapping-Techniken und Gradient Shimming diese oft zeitraubende Aufgabe der Anpassung der Shim-Einstellungen für jede Probe vereinfacht. Es wird jedoch Proben geben, bei denen die Shim-Maps nicht gut funktionieren, und es muss Zeit für die Einstellung der Shims aufgewendet werden, um eine optimale Reaktion des Instruments zu erreichen.
Die Bewertung der Empfindlichkeit des Spektrometers mit Standardproben ist ein ideales Mittel, um die Systemleistung zu verfolgen, und die bei den Standardtests erhaltenen Werte müssen den vom Hersteller festgelegten Spektrometerspezifikationen entsprechen oder diese übertreffen. Dabei ist zu beachten, dass die Spektrometerspezifikationen vom Hersteller oft auf konservative Weise festgelegt werden, um sicherzustellen, dass das Gerät diese Tests bei der Installation besteht. Die regelmäßige Durchführung der OQ/PQ-Tests ermöglicht es dem Besitzer des Spektrometers jedoch, sich mit den Fähigkeiten seines Geräts vertraut zu machen. Abweichungen von den durch Routinetests ermittelten Werten sollten sorgfältig geprüft werden, da sie auf eine Fehlfunktion des Geräts hindeuten könnten.
Bei der Analyse kleiner Moleküle in organischen Lösungsmitteln führt die Verwendung des Acetonsignals in deuteriertem Chloroform nicht nur zu einer Lorentz-Linienform und einer schmalen FWHH, sondern auch zu einer schmalen Basis (z. B. <20 Hz bei den 20 % des 13C-Satellitensignals) in der Regel zur besten Empfindlichkeit für Ethylbenzolsignale in deuteriertem Chloroform. Bei Spektrometern, die für die Aufnahme von Spektren in wässrigen Lösungen verwendet werden, ist eine zweite Empfindlichkeitsmessung wichtiger: die Fähigkeit des Spektrometers, eine gute Empfindlichkeit und Auflösung von Signalen in der Nähe des Wasserpeaks zu erzielen. Daher ist die Messung der Empfindlichkeit mit den anomeren Protonensignalen eines Standards aus 2 mM Saccharose in 95 % H2O/5 % D2O-Lösung mit angewendeter Wassersuppression ein realistischeres Maß für die Signal-Rausch-Leistung des Spektrometers bei der NMR von therapeutischen Proteinproben.
Für eine PQ auf einem Spektrometer, das die Qualität von Proteintherapeutika bewertet, ist ein kritisches Qualitätsmerkmal dieser Medikamente eine spezifische Tertiärstruktur, die durch die Faltung der Aminosäurekette entsteht. Als PQ auf einem Spektrometer, das eine 2D-Strukturkartenanalyse durchführt, können daher 2D-HSQC-Spektren in kurzer Zeit an einer mit 15N- oder 13C-Isotopen angereicherten Probe durchgeführt werden, um die Fähigkeit des Spektrometers zur Durchführung von Pulsprogrammen mit effizienten Entkopplungsschemata und Gradientenkohärenzauswahl zu testen. 13C- oder 15N-isotopenangereicherte Protein-Standardlösungen (z. B. SH3-Domänenproteine oder Ubiquitin) in versiegelten Röhrchen sind im Handel in Konzentrationen erhältlich, die eine Datenerfassung innerhalb weniger Stunden ermöglichen. Mit entsprechend kalibrierten Spektrometern bei 500 MHz und darüber, die mit einer Kryosonde ausgestattet sind, können 2D-Strukturkarten von Proteinen in natürlicher Häufigkeit (d. h. nicht isotopenangereichert) bei einer Konzentration von ∼1,0 mM in 2-3 Tagen gemessen werden.