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DISKUSSION
Das DNA-Synthesom-Modellsystem enthält alle Proteine, die zur Unterstützung jeder Phase des DNA-Replikationsprozesses benötigt werden, und diese Proteine haben unter den derzeitigen Testbedingungen eine Größe von 20 bis 240 kDa und können alle Phasen des DNA-Replikationsprozesses in vitro durchführen. In dieser Studie wurde die Synthesom-assoziierte DNA-Primase-Aktivität charakterisiert, indem die Synthese und Verlängerung von RNA-Primern untersucht wurde, die in vitro durch das DNA-Synthesom katalysiert werden. Die Ergebnisse unserer funktionellen Analysen zeigen, dass die Synthesom-assoziierte DNA-Primase-Aktivität in der aus Brustkrebszellen gewonnenen P4-Fraktion 30-mal höher ist als in rohen Brustkrebszellextrakten. Die P4-Fraktion, die das DNA-Synthesom enthält, wurde aus den kombinierten nukleären und zytoplasmatischen löslichen Proteinfraktionen von MCF7-Zellen gewonnen und für die Durchführung des SV40-In-vitro-DNA-Replikationstests verwendet. Die Aktivitäten der DNA-Polymerase α und δ und der DNA-Primase in der P4-Fraktion sind 20-40 mal höher als die von rohen Zellextrakten, was sie zu einem nützlichen Werkzeug für diese Studien macht, da sie vollständig in der Lage ist, die Synthese und Verlängerung von RNA-Primern in einem In-vitro-Modellsystem zu unterstützen, das nachweislich alle Phasen des DNA-Replikationsprozesses unterstützt.
Die DNA-Primase weist eine einzigartige Prozessivität bei der Synthese und Verlängerung von RNA-Primern auf. Diese Prozessivität ist durch einen Wettbewerb zwischen der Addition des nächsten korrekten Nukleotids und der Dissoziation des Primer-Template-Komplexes definiert. Die DNA-Primase ist das einzige Enzym, das in der Lage ist, während des Beginns der DNA-Synthese RNA-Primer zu synthetisieren. Keine der einzelnen Primase-Untereinheiten ist in der Lage, selbständig einen RNA-Primer zu synthetisieren oder zu verlängern. Das Synthesom enthält beide Primase-Untereinheiten (d. h. p49 und p58) und kann die Synthese von RNA-Primern in vitro unter Verwendung einer exogenen poly(dT)-Matrize katalysieren. Das Synthesom synthetisiert einen funktionellen RNA-Primer von Einheitslänge (7-10 nt). Diese RNA-Primer werden von der RNase vollständig in kurze Fragmente von 1-4 bp hydrolysiert, aber nicht von der DNase hydrolysiert. Das Hauptmerkmal der Synthesom-assoziierten Primase, das sie von einer isolierten DNA-Primase unterscheidet, ist ihre spezifische Fähigkeit, den RNA-Primer zu verlängern und einen DNA-Primerstrang zu bilden. Die Synthese eines DNA-Primerstrangs erfordert neben der DNA-Primase-Aktivität auch eine DNA-Polymerase-Aktivität. Die DNA-Polymerase-Aktivität wird normalerweise umgeschaltet, um die Verlängerung eines RNA-Primers nach der Primersynthese zu starten. Nur RNA-Primer, die ≥7 Nukleotide lang sind, werden von der Polymerase verwertet, unabhängig von der dNTP-Konzentration. Die Synthese und Verlängerung von RNA-Primern mit Einheitslänge erfordert also nicht nur Primase, sondern auch die DNA-Polymerase-α-Untereinheit p180 , und das Synthesom enthält hochaktive DNA-Polymerasen, die den Einbau von Desoxyribonukleotiden zur Verlängerung des RNA-Primers katalysieren. Die RNA-Primer werden von den mit dem Synthesom verbundenen Polymerasen aus einem DNA-RNA-Oligoprimer von 20-40 nt Länge (DNA-Primer) verlängert. Die DNA-Primerstränge enthalten zwei Komponenten: (1) ein Ribonukleotid von 10 nt und (2) ein Desoxyribonukleotid von 20-40 nt. RNase und DNase hydrolysieren die entsprechenden Komponenten der DNA-Primärstränge getrennt, was zu einer Verkürzung, aber unvollständigen Hydrolyse des DNA-Primärstrangs führt.
Ein weiteres Merkmal des Synthesoms ist die schnelle Synthese und die unterschiedlichen Größen des RNA-Primers und des DNA-Primärstrangs. Das Synthesom katalysiert die Synthese sowohl eines RNA-Primers als auch eines DNA-Primerstrangs rasch, und die Gleichgewichtsmengen scheinen sich innerhalb von 5-15 Minuten zu akkumulieren. Die Größe des RNA-Primers (7-10 nt) und des DNA-Primerstrangs (20-40 nt), die durch das DNA-Synthesom katalysiert werden, bleibt unabhängig von der Synthesomkonzentration oder der Reaktionszeit immer konstant. Diese Studie über den Mechanismus der DNA-Primase-Aktivität deutet darauf hin, dass die Synthese von RNA-Primern, die von der mit dem Synthesom assoziierten Primase katalysiert wird, über eine langsame Initiierung, eine schnelle Polymerisation und eine „intelligente“ Terminierung des Primers erfolgt. Die DNA-Primase bindet an die DNA-Vorlage und leitet langsam die Synthese eines Dinukleotids ein. Nach der Synthese des Dinukleotids werden zusätzliche NTPs schnell an das von der DNA-Primase polymerisierte Dinukleotid angehängt. Die Aktivität der DNA-Primase ist dadurch gekennzeichnet, dass sie jeden RNA-Primer in einem einzigen Aktivitätsschub synthetisiert und nicht durch eine distributive Synthese. Sobald Primer mit einer Länge von 7-10 nt erzeugt wurden, wirkt das Primase-Template als Terminierungssignal und hemmt die weitere RNA-Synthese. Diese Hemmung ist auf die Bildung eines stabilen Primer-Templates zurückzuführen, das wahrscheinlich mit dem Pol-α-Primase-Komplex verbunden bleibt. Interessanterweise ähneln die vom DNA-Synthesom in vitro synthetisierten DNA-Primerstränge den in vitro synthetisierten, durch das Synthesom katalysierten RNA-Primern. Die Synthese eines DNA-Primerstrangs erreicht schnell ein stabiles Niveau und die Größe des DNA-Primerstrangs bleibt relativ konstant (zwischen 20 und 40 nt), unabhängig von der Reaktionszeit oder der Konzentration des Synthesoms, die während der Synthesereaktion verwendet wird. Die Synthese des DNA-Primerstrangs erfordert neben der DNA-Primase auch die Aktivität der DNA-Polymerase α. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Synthesom-assoziierte Polymerase-α-Aktivität auch durch eine schnelle Polymerisation und „intelligente“ Terminierung bei der Synthese des DNA-Primerstrangs gekennzeichnet ist. Das Synthesom mit der Eigenschaft der schnellen Polymerisation und der intelligenten Terminierung des DNA-Primerstrangs unterscheidet sich von der Synthese, die durch das Klenow-Fragment der E. coli DNA-Polymerase I während der Verlängerung des RNA-Primers vermittelt wird. Im Gegensatz zum Synthesom hängt die von der Polymerase I katalysierte Verlängerung des RNA-Primers stark von der Länge der Reaktionszeit ab. Eine Verlängerung der Reaktionszeit erhöht die Menge und Größe der verlängerten RNA-Primer erheblich.
Zwei mögliche Mechanismen wurden vorgeschlagen, um den Wechsel von der Primersynthese zur Primerverlängerung während des DNA-Replikationsprozesses zu erklären. Der erste Mechanismus sieht vor, dass der Primase-Polymerase-Komplex von der Primer-Template dissoziiert und sich mit der aktiven Stelle der Polymerase neu assoziiert. Die zweite besagt, dass der Wechsel durch eine Intrastrang-Translokation des Pol-α-Primase-Komplexes von der aktiven Stelle der Primase zur aktiven Stelle der Polymerase α erfolgt. Dieser Wechsel beinhaltet keine Dissoziation des Pol-α-Primase-Komplexes von der DNA-Vorlage. Unsere Experimente zeigen, dass die Polymerase I-katalysierte RNA-Primer-Verlängerung durch hohe Konzentrationen des DNA-Synthesoms gehemmt wird. Die Fähigkeit des Klenow-Fragments, einen RNA-Primer zu verlängern, hängt von der Synthese von RNA-Primern ab, die durch das Synthesom katalysiert wird, das ebenfalls eine verfügbare Bindungsstelle am RNA-Primer-Terminus benötigt. Daher erfordert das Klenow-Fragment der E. coli-Polymerase I die Dissoziation des Primase-Polymerase-Komplexes von der Primer-Template. Hohe Konzentrationen des Synthesoms konkurrieren jedoch mit der Polymerase I um die Bindungsstelle auf der Primer-Template, so dass die Verlängerung des RNA-Primers gehemmt wird. Das Synthesom bildet einen Sackgassen-Komplex am RNA-Primer-Terminus, was dazu führt, dass das Klenow-Fragment nicht an der RNA-Primer-Verlängerung teilnehmen kann. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass der Polymerase-Primase-Komplex des DNA-Synthesoms nach der Synthese des RNA-Primers von der Primer-Platte dissoziieren muss. Unser Ergebnis zeigt, dass das Synthesom die Größe des RNA-Primers mit Einheitslänge erhöht, wenn die Reaktionstemperatur verringert wird. Die Verringerung der Reaktionstemperatur erhöht die Effizienz der Umschaltung des Polymerase-Primase-Komplexes und verringert die Denaturierung der Primer-Template. Darüber hinaus enthält die DNA-Primase-Untereinheit p49 die katalytische Aktivität der RNA-Polymerase, die zur Vergrößerung des RNA-Primers mit Einheitslänge benötigt wird. Daher deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass das DNA-Synthesom über die entsprechende RNA-Polymerase-Aktivität verfügt, die zur Bildung von RNA-geprimten DNA-Fragmenten erforderlich ist.
Die kinetische Analyse der RNA-Primer-Initiation und -Elongation zeigt, dass die Synthesom-assoziierte DNA-Primase ein langsames und relativ schwaches Enzym in Bezug auf die Template-Bindung ist. Die DNA-Primase ist auch eine fehleranfällige Nukleinsäurepolymerase, da dieses Enzym eine sehr schlechte Fähigkeit zur Nukleotidunterscheidung besitzt, was zu einem Fehleinbau von Nukleotiden führt. Unsere Analyse der enzymatischen Kinetik der Synthesom-assoziierten DNA-Primase-Aktivität könnte daher zur Bestimmung des Verhältnisses von Syntheseraten und Fehlerhäufigkeiten bei der Synthese von RNA-Primern genutzt werden. Die diskontinuierliche Synthese von DNA-Fragmenten (Okazaki) auf dem nacheilenden Strang der Replikationsgabel ist ein wichtiger biochemischer Prozess während der DNA-Replikation. Um eine wirksame Koordination zwischen der kontinuierlichen DNA-Synthese auf dem führenden Strang und der diskontinuierlichen DNA-Synthese auf dem nacheilenden Strang zu gewährleisten, benötigt die DNA-Primase eine genau getaktete Reihe von Enzymschritten, die die Synthese des RNA-Primers steuern. Eine kinetische Studie eines Multiprotein-Replikationskomplexes aus dem Bakteriophagen T7 zeigt, dass die Primase als molekulare Bremse wirkt und das Fortschreiten der Replikationsgabel vorübergehend stoppt. Aufgrund der physikalischen Interaktion der DNA-Polymerase δ mit Pol α legt das von Lee et al. präsentierte Ergebnis nahe, dass die DNA-Primase in der Lage sein könnte, zu verhindern, dass die Synthese des vorderen Strangs die Synthese des hinteren Strangs während der langsamen enzymatischen Schritte auf dem hinteren Strang überholt.
Viele eukaryotische DNA-Replikationsmodelle wurden für die Untersuchung der Funktion der DNA-Primase verwendet. Das Kernmatrix-Replikationssystem von Ganzzell-Lysat wurde verwendet, um die Synthese und Verteilung von nativen RNA-Primern und RNA-geprimter naszierender DNA in eukaryotischen Zellkernen unter Verwendung endogener, an die Kernmatrix gebundener doppelsträngiger DNA-Vorlagen zu untersuchen. RNA-Primer sind eng mit der Kernmatrix von sich schnell vermehrenden Säugetierzellen verbunden. RNA-Primer werden kovalent an neu replizierte DNA angehängt, um RNA-geprimte naszierende DNA zu bilden. Die RNA-geprimte DNA wird nach dem DNase-Verdau zu einigen Oligoribonukleotiden von ~10 nt Länge abgebaut, und mindestens 94 % der nativen RNA-Primer und der RNA-geprimten naszierenden DNA befinden sich in der unlöslichen Matrixfraktion des Zellkerns. RNA-Primer mit einer Länge von 8-10 nt, die mit der Kernmatrix assoziiert sind, machen <1 % der gesamten RNA in der Zelle aus; dies macht es sehr schwierig, RNA-Primer und RNA-primierte naszierende DNA in der Zellkernmatrixfraktion zu untersuchen, da die Konzentration von RNA-Primern sehr gering ist und die Menge anderer RNAs relativ groß ist. Darüber hinaus ist die Isolierung von RNA-Primern und RNA-geprimter naszenter DNA aus radioaktiv markierten Ganzzelllysaten ein kompliziertes und nicht triviales Reinigungsverfahren, wenn es um die Analyse der durch das Kernmatrix-Replikationsmodell vermittelten RNA-Primersynthese geht. Im Gegensatz dazu enthält das aus den kombinierten Kern- und Zytoplasmafraktionen gereinigte DNA-Synthesom hochaktive DNA-Primase und DNA-Polymerasen und unterstützt die Synthese nativer RNA-Primer in vitro unter Verwendung einer doppelsträngigen, SV40-ursprungshaltigen DNA-Vorlage vollständig. Die vom DNA-Synthesom synthetisierten RNA-Primer haben eine normale Länge (10-20 Nukleotide) und scheinen ordnungsgemäß zu funktionieren, um die Primerverlängerung durch DNA-Polymerase zu unterstützen. Diese RNA-Primer können leicht verlängert werden, um RNA-geprimte naszierende DNA von 100-200 nt zu bilden. Die diskontinuierliche Synthese von DNA-(Okazaki-)Fragmenten auf dem nacheilenden Strang der Replikationsgabel ist ein wichtiger biochemischer Prozess bei der DNA-Replikation, und RNA-geprimte DNA-(Okazaki-)Fragmente in voller Länge, die vom DNA-Synthesom synthetisiert werden, sind ebenfalls etwa 100-200 Nukleotide lang. Wir haben beobachtet, dass das DNA-Synthesom verschiedene RNA-geprimte Produkte mit einer Länge von 10 bis 200 nt synthetisieren kann. Dies kann als plausibel angesehen werden, da die nativen RNA-Primer und die RNA-geprimte naszierende DNA ebenfalls diese ungefähre Länge aufweisen. Die obige Beobachtung, dass die durch das DNA-Synthesom katalysierte Synthese von RNA-Primern und RNA-geprimter naszenter DNA im Wesentlichen derjenigen der Studie entspricht, die unter Verwendung des Kernmatrix-Replikationsmodells von Ganzzell-Lysat veröffentlicht wurde, deutet darauf hin, dass das DNA-Synthesom ein ausgezeichnetes Modellsystem ist, das in der Lage ist, einen physiologisch sinnvollen DNA-Replikationsprozess in vitro durchzuführen.
Das DNA-Synthesom-Modell ist daher ein einzigartiges und wertvolles Instrument für die Untersuchung der DNA-Primase-Funktion. Die Primase-vermittelte Synthese und Verlängerung der RNA-Primersynthese und -elongation, die durch das DNA-Synthesom durchgeführt wird, ähnelt derjenigen, die durch andere zellfreie Replikationsmodelle durchgeführt wird. Das Synthesom-Modell unterstützt die Synthese und Verlängerung von RNA-Primern in vitro unter Verwendung von exogenen einzelsträngigen DNA-Vorlagen sowie von superspiralisierter doppelsträngiger DNA, die einen intakten SV40-Replikationsursprung enthält. Das DNA-Synthesom ist also durchaus in der Lage, die Synthese und Verlängerung von RNA-Primern in vitro zu vermitteln, und kann die weitere Erforschung der Mechanismen erleichtern, die die DNA-Synthese in eukaryontischen Zellen initiieren. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass das Synthesom-Modell ein einzigartiges Instrument zur Untersuchung der Interaktion von DNA-Primase und anderen Replikationsproteinen während des DNA-Replikationsprozesses darstellt.