Produktion von menschlichem Albumin in Schweinen durch CRISPR/Cas9-vermitteltes Knockin von menschlicher cDNA in den Schweine-Albumin-Locus in den ZygotenMediated Knockin of Human cDNA into Swine Albumin Locus in the Zygotes
Humanserumalbumin (HSA) ist das am häufigsten vorkommende Plasmaprotein, das entscheidende homöostatische Funktionen in der menschlichen Physiologie erfüllt, einschließlich der Aufrechterhaltung des onkotischen Plasmadrucks, Regulierung der Verteilung von Körperflüssigkeiten, Transport kleiner Moleküle usw.1. Es wird bei einer Reihe von schweren Erkrankungen wie Leberversagen und traumatischem Schock verschrieben2. Aufgrund des Mangels an menschlichem Blut und der mit menschlichem Blut verbundenen Risiken wird seit langem nach Alternativen zur Herstellung von menschlichem Albumin gesucht. Die rekombinante HSA-Produktion wurde bereits bei Schweinen durch dominante Transgenexpression in Form einer Albumin-GFP-Fusion versucht3. Bei transgenen Ansätzen sind jedoch aufgrund des Vorhandenseins von endogenem Schweinealbumin die Abtrennung und Reinigung des rHSA problematisch. Unter Ausnutzung der Leistungsfähigkeit des CRISPR/Cas9-Systems bei der Genomveränderung haben wir versucht, rHSA in Schweinen zu erzeugen, indem wir die menschliche Albumin-cDNA in den Schweinealbumin-Locus klopften. Durch Einfügen der menschlichen ALB-cDNA plus SV40-PolyA-Signalsequenz (insgesamt 2368 bp) in den Albumin-Lokus des Schweins unmittelbar stromabwärts des Startcodons erwarten wir, dass menschliches ALB unter der Transkriptionskontrolle des endogenen Albumins des Schweins exprimiert wird und gleichzeitig die Expression des endogenen Albumins des Schweins blockiert (Abb. 1a). Wir entwarfen eine sgRNA, die auf die Region des Startcodons abzielt (unmittelbar 5′ von und einschließlich ATG), und erzeugten ein Targeting-Fragment (Donor für homologe Rekombination) mit dem Insert, das von 1 kb Homologiesequenzen auf beiden Seiten flankiert wird (Abb. 1a). Da die im Donor verwendete 5′-Homologiesequenz bis zum Startcodon verläuft, enthält sie die sgRNA-Sequenz und kann somit von der sgRNA als Donor oder dem Knockin-Allel nach homologer Rekombination angegriffen werden. Um dies zu verhindern, haben wir 6 bp (gccacc) in die sgRNA-Sequenz direkt vor dem Startcodon eingefügt. Die sgRNA wurde in vitro transkribiert, gereinigt und zusammen mit Cas9 mRNA4 und dem zirkulären Vektor, der das Targeting-Fragment enthält, in die befruchteten Oozyten injiziert. Als Quelle für die Eizellen diente das Bama-Minischwein5. Die injizierten Embryonen wurden 1-2 Stunden lang kultiviert, bevor sie in brünstigkeitssynchronisierte Weibchen implantiert wurden. ~Etwa 300 Embryonen wurden in 10 Weibchen implantiert, von denen 5 trächtig wurden und insgesamt 16 lebende Welpen zur Welt brachten. Die Welpen wurden standardmäßig versorgt und zeigten keine Anzeichen für ungewöhnliche Gesundheitsprobleme.
Knockin von menschlichem ALB in den Alb-Locus des Schweins.
(a) Schema der Knockin-Strategie. (b) Genotypisierung des Gründers. Die PRC-Primer sind in (a) dargestellt. (c) Sequenzierungsergebnisse der mit Primerpaar e/f (a) erhaltenen PCR-Produkte. Die Produkte wurden kloniert und bis zu 12 Klone (für #9) wurden sequenziert.
Wir schnitten die Ohrspitzen der 16 Ferkel ab, als sie etwa 4 Wochen alt waren, und gewannen genomische DNA für die Genotypisierung. Um festzustellen, ob wir erfolgreich geknockt hatten, untersuchten wir sowohl das 5′- als auch das 3′-Ende der Insertionsstelle. Wir verwendeten zwei Primerpaare, a/b und c/d (Abb. 1a). Primer a liegt außerhalb des 5′-Endes der verwendeten Homologie und b befindet sich auf menschlichem ALB (dem Insert); c liegt auf menschlichem ALB und d außerhalb des 3′-Endes der Homologie. Wie in Abb. 1b gezeigt, tragen alle 16 Ferkel das gewünschte Knockin-Allel. Wir klonierten und sequenzierten alle amplifizierten DNA-Fragmente. Sie waren die erwarteten homologen Rekombinationsprodukte (Abb. S1). Anschließend bestimmten wir den Status des Wildtyp-Allels in diesen Ferkeln. Die Primer e und f (im Insert enthalten) (Abb. 1a) sollten ein 705 bp-Fragment vom Wildtyp-Locus und ein 3085 bp-Fragment vom Knockin-Allel amplifizieren. Wie erwartet, erzeugten alle das 3085-bp-Fragment. Unerwarteterweise konnten wir jedoch das offensichtliche 705 bp Wildtyp-Fragment nur von 7 (# 5, 6, 9, 10, 12, 13 und 15) der 16 Proben erhalten, während der Rest schwache Produkte um 700 bp erzeugte (Abb. 1b). Das offensichtliche Fehlen des Wildtyp-Allels bei einigen Ferkeln deutet darauf hin, dass Knockin auf beiden Allelen stattgefunden haben könnte. Alternativ könnte das Wildtyp-Allel so editiert worden sein, dass die Primer-a-Sequenz deletiert wurde, was dazu führte, dass das Wildtyp-Allel nicht amplifiziert werden konnte. Tatsächlich wurde das Wildtyp-Allel editiert, da die Größe der amplifizierten Fragmente bei einigen Ferkeln von den vorhergesagten 705 bp abwich (Abb. 1b). Um dies zu bestätigen, klonierten und sequenzierten wir alle amplifizierten Fragmente. Wie in Abb. 1c zu sehen ist, waren alle editiert, auch wenn es sich bei einigen nur um wenige Basenpaare handelte (sie schienen also bei 705 bp zu liegen). Unter diesen editierten Allelen sind die in Ferkel Nr. 10 und Nr. 12 gefundenen von Interesse. Das Allel in Ferkel Nr. 10 war das Ergebnis des Ersetzens eines Abschnitts von 29 Basenpaaren (vom ATG zum 3′-Ende) der Schweinesequenz durch 36 Basenpaare (6 Basenpaare 5′ vom ATG und 26 Basenpaare danach) der Spendersequenz. Es ist unklar, wie dies geschehen ist. In #12 gibt es zwei verschiedene editierte Allele, was die Gesamtzahl der Allele auf 3 erhöht, was auf Mosaizismus in diesem Ferkel hinweist, was nicht ungewöhnlich ist, da Mosaizismus häufig bei Tieren gefunden wurde, die durch Zygoteninjektion von Cas9/sgRNA6,7,8,9,10 erzeugt wurden.
Um festzustellen, ob mit der sgRNA ein Off-Targeting stattgefunden hatte, wählten wir 4 potenzielle Top-Off-Target-Sites auf der Grundlage von Vorschlägen des CRISPR-Design-Tools (http://tools.genome-engineering.org) aus und amplifizierten Fragmente, die diese Sites enthielten, aus der genomischen DNA der Ohrspitze von Ferkel Nr. 14. Die Fragmente wurden einem T4EN I-Test unterzogen4. Wie in Abb. S2 gezeigt, wurde kein Off-Target-Editing festgestellt. Wir konnten jedoch nicht ausschließen, dass Off-Target-Editing an anderen Loci oder in den anderen 15 transgenen Schweinen stattfand. Doch selbst wenn ein Off-Target-Editing stattgefunden hat, sind die editierten Loci für unseren Zweck der Herstellung von rHSA wahrscheinlich unproblematisch, solange sie das Wohlergehen dieser transgenen Schweine nicht beeinträchtigen.
Nachdem wir ein erfolgreiches Knockin des menschlichen ALB nachgewiesen hatten, wollten wir feststellen, ob im Blutplasma dieser Knockin-Ferkel menschliches Albumin nachgewiesen werden kann. Wie in Abb. 2a gezeigt, enthielten alle Ferkel Humanalbumin in ihrem Blutplasma, das mit den gegen Humanalbumin spezifischen Antikörpern nachgewiesen werden konnte, wenn auch in unterschiedlichen Mengen, was wahrscheinlich auf mindestens zwei Faktoren zurückzuführen ist, nämlich darauf, ob beide Allele knockin sind und auf das Ausmaß des Mosaizismus (insbesondere in der Leber). Der Gehalt in #7 ist sehr niedrig und wird erst nach langer Belichtung des Blots sichtbar, obwohl das Wildtyp-Schweinealb-Allel offensichtlich fehlt (Abb. 1a). Insgesamt sind die Werte viel niedriger als die in erwachsenen menschlichen Seren. Es ist bekannt, dass die Blutalbuminkonzentration bei Schweinen mit dem Alter ansteigt und im Alter von 6 Monaten ein ähnliches Niveau wie bei erwachsenen Menschen erreicht11.
Analyse von humanem ALB im Blut.
(a) Western-Blot-Nachweis von humanem Albumin im Blut von Gründerferkeln. 0,5 μl Plasma von jedem Gründer wurde auf SDS-PAGE getrennt und analysiert. Menschliches Blutplasma (0,5 μl nach 30-facher Verdünnung) wurde als Positivkontrolle verwendet. C, Plasma von einem Wildtyp-Schwein. (b) Illustration der tryptischen Peptide (grün), die mit der Massenspektrometrie nachgewiesen wurden. (c) Semi-Quantitierung von zwei tryptischen Peptiden aus Human- und Schweinealbumin durch Messung der Peakflächen der einzelnen Peptide. Rot markiert sind die Aminosäurereste, die spezifisch für das Schwein sind.
Um zu bestätigen, dass das im Plasma unserer Knockin-Ferkel mit Antikörpern nachgewiesene rHSA tatsächlich menschliches Albumin ist, haben wir zwei Plasmaproben (Ferkel Nr. 2 und Nr. 6) einer Massenspektralanalyse unterzogen. #Ferkel Nr. 2 ist offensichtlich homozygot für das Knockin-Allel und Ferkel Nr. 6 enthält ein Knockin- und ein mutiertes Allel (Frameshift) (Abb. 1). 0,5 μl Plasma wurden auf SDS-PAGE aufgetrennt und Proteine um 70 KD wurden mit Trypsin im Gel verdaut. Die tryptischen Peptide wurden aus dem Gel eluiert, getrocknet und für die Trennung durch Flüssigchromatographie und Massenspektrometrie wieder aufgelöst. Für Ferkel Nr. 2 konnten wir 14 und für Ferkel Nr. 6 15 einzigartige tryptische Peptide des menschlichen ALB nachweisen (Abb. 2b). Die M/Z-Spektren für das menschliche Peptid FKDLGEENFK und das Schweinepeptid FKDLGEQYFK (beide von Ferkel Nr. 2) sind in Abb. S3 dargestellt. Zwei Peptide wurden zur Quantifizierung durch Messung der Peakflächen ausgewählt. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen des Western Blot waren diese beiden Peptide in Ferkel Nr. 2 wesentlich häufiger (~5 mal) als in Ferkel Nr. 6 (Abb. 2c). Diese Ergebnisse zeigen, dass es sich bei dem von den Antikörpern nachgewiesenen rHSA um authentisches menschliches Albumin handelt.
Die Genotypisierung der aus den Ohrspitzen isolierten DNA zeigt, dass sowohl #2 als auch #6 kein Wildtyp-Schwein-Alb-Allel enthalten, entweder nicht vorhanden oder editiert (Abb. 1b,c). Dennoch konnten wir in beiden Proben tryptische Peptide von Schweinealbumin nachweisen, wenn auch in wesentlich geringerer Menge (Abb. 2c). Interessanterweise war die Abundanz der Schweinepeptide in beiden Proben etwa gleich, obwohl die Abundanz der menschlichen Peptide sehr unterschiedlich war. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass beide Ferkel eine ähnliche Anzahl von Wildtyp- (oder heterozygoten) Hepatozyten enthalten, die für das im Blut dieser beiden Ferkel nachgewiesene Schweine-ALB verantwortlich sind. Es ist jedoch möglich, dass solche Wildtyp-Allele enthaltenden Zellen in den Ohrspitzen nicht oder nur in einem extrem geringen Prozentsatz vorhanden sind, so dass das Wildtyp-Allel nicht mittels PCR amplifiziert werden konnte. Darüber hinaus wies die Southern-Blot-Analyse mit einer internen Sonde (3′ Hälfte des menschlichen ALB-CDS) auf das Vorhandensein einer zusätzlichen Insertion der Donor-Sequenz in den Ferkeln Nr. 1, 4 und 5 hin (Abb. S4). All diese Komplikationen werden bei der Herstellung von rekombinantem Humanalbumin keine Rolle spielen, da das Knockin-Allel durch Rückkreuzung gereinigt werden kann.
Um festzustellen, ob das Knockin-Allel auf die nächste Generation übertragen werden kann, kreuzten wir #2 (männlich, homozygot) mit #5 (weiblich, heterozygot), als sie fortpflanzungsfähig waren. Aus der Kreuzung gingen 6 Welpen hervor. 4 von ihnen (#1, 3, 4 und 6) sind homozygot für das Knockin-Allel (AlbH/H, H steht für Mensch) und 2 (#2 und 5) heterozygot (AlbP/H, P steht für Schwein) (Abb. 3a). #Nr. 5 und 6 starben etwa 2 Wochen nach der Geburt an Durchfall. Wir analysierten die Expression von humanem Albumin im Blut der verbleibenden Ferkel im Alter von 4 Wochen. Wie in Abb. 3b zu sehen ist, haben alle Ferkel Humanalbumin im Blut. Interessanterweise war der Gehalt an humanem Albumin bei dem heterozygoten Tier (Nr. 2) viel niedriger als bei den Homozygoten. Wir wissen nicht, ob dies ein Ergebnis individueller Variation ist oder ob das Knockin-Allel irgendwie durch das Wildtyp-Allel unterdrückt wird.
Keimbahnübertragung des Knockin-Allels.
(a) PCR-Genotypisierung der F1-Nachkommen. Die verwendeten Primer sind die gleichen wie in Abb. 1. (b) Westernblot-Nachweis von humanem Albumin im Blut der F1-Ferkel. 0,5 μl Plasma von jedem Ferkel wurden auf SDS-PAGE getrennt und analysiert. C, Plasma von einem Wildtyp-Schwein. M, Molekulargewichtsmarker.
Wir zeigen hier die erfolgreiche Erzeugung von Schweinen, die menschliche ALB cDNA in den Alb-Locus des Schweins einklopfen. Dies ist ein Schritt weiter als das einfache Gene Editing in Schweinezygoten, über das Hai et al.12 und wir13 kürzlich berichteten. Große domestizierte Tiere wurden als Bioreaktoren für biomedizinische Proteinprodukte genutzt14,15,16,17,18,19,20. In der Regel wurden die kodierenden Sequenzen dieser Proteine zusammen mit den erforderlichen Transkriptionskontrollelementen zufällig als Transgene in das Genom eingefügt, was mit vielen Komplikationen verbunden ist, u. a. mit der Kurzlebigkeit der Transgenexpression. Unsere Demonstration, dass homologe Rekombination in Schweinezygoten hocheffizient ablaufen kann, öffnet die Tür für die Entwicklung immer besserer Bioreaktoren sowie von Nutztierstämmen mit immer mehr wünschenswerten Eigenschaften.