Frontiers in Neuroscience

Frontiers in Neuroscience

Introduction

De generatie van nieuwe neuronen in de volwassen hippocampus, een hersengebied dat betrokken is bij ruimtelijke navigatie en geheugenvorming (Buzsaki en Moser, 2013), is een opvallende vorm van plasticiteit die het hele leven blijft bestaan bij verschillende diersoorten, waaronder de mens (Altman en Das, 1965; Eriksson et al, 1998; Moreno-Jiménez et al., 2019). Onder de vele omstandigheden die de volwassen hippocampale neurogenese reguleren, is een van de meest betrouwbare processen die op grote schaal is beschreven de leeftijdsgemedieerde afname van de neuronale productie, terwijl reeds bestaande neuronale populaties constant blijven bij normale veroudering (Kuhn et al., 1996; Kempermann et al., 1998; Burke en Barnes, 2010). Veroudering beïnvloedt vele functies in de hersenen, waaronder synaptische transmissie en plasticiteit, waarvan wordt gedacht dat ze bijdragen aan geheugenverlies (Burke en Barnes, 2006; Fan et al., 2017). Gezien het feit dat de hippocampus bijzonder kwetsbaar is voor leeftijdsgerelateerde veranderingen en neurodegeneratie, wordt het vinden van strategieën om de plasticiteit in deze structuur te versterken relevant om de effecten van veroudering te voorkomen of te verlichten (Bartsch en Wulff, 2015). Lichamelijke oefening en cognitieve stimuli verbeteren de gezondheid van de hersenen en hebben de neiging om de effecten van veroudering te verlichten. Een van de directe voordelen kan voortkomen uit de activiteitsafhankelijke verhoging van de niveaus van de brain-derived neurotrophic factor (BDNF), waarvan is aangetoond dat het de synaptische plasticiteit herstelt, de neurogenese versterkt en het leren verbetert bij muizen van middelbare leeftijd (Marlatt et al., 2012; Trinchero et al., 2017). Lichaamsbeweging vermindert ook microglia-activatie, verhoogt activiteitsafhankelijke synaptische plasticiteit, proliferatie van neurale progenitorcellen en versnelt de ontwikkeling en integratie van volwassen geboren granulecellen (GC’s) in de verouderende hippocampus (van Praag et al., 2005; Kronenberg et al., 2006; O’Callaghan et al., 2009; Marlatt et al., 2012; Gebara et al., 2013). Deze effecten dragen bij aan het herstel van hippocampus-afhankelijke plasticiteit en correleren met adaptief gedrag. Zo verbeteren bejaarde dieren die slecht presteren in ruimtelijk leren en patroonscheidingstaken, hun prestaties na oefening (van Praag et al., 2005; Marlatt et al., 2012; Wu et al., 2015; Duzel et al., 2016; Xu et al., 2017).

In hoeverre neurogenese bijdraagt aan de positieve gedragseffecten van oefening bij bejaarde dieren is nog onderwerp van onderzoek. Het is mogelijk dat de toename van de snelheid van neurogenese uitgeoefend door lichaamsbeweging bijdraagt aan gedragsverbetering. Maar ook andere mechanismen kunnen een rol spelen (Meshi et al., 2006). De versnelde integratie van nieuwe neuronen in de ouder wordende dentate gyrus na inspanning, die de kwaliteit van nieuwe GC’s wijzigt, kan ook bijdragen aan gedragsverbetering. Terwijl neuronen geboren in muizen van middelbare leeftijd zich langzaam ontwikkelen, bevordert aanhoudende vrijwillige lichaamsbeweging dendritische groei, wervelkolomvorming en neuronale integratie (Trinchero et al., 2017). Vergelijkbare effecten werden waargenomen door korte blootstellingen aan omgevingsverrijking (EE) (Trinchero et al., 2019). Indien geaccumuleerd over meerdere neuronale cohorten, zou de versnelde neuronale integratie getriggerd door oefening een aanzienlijke invloed kunnen uitoefenen op hippocampus-afhankelijk leren en gedrag. In dit werk tonen we aan dat verschillende cohorten van nieuwe GC’s snel kunnen worden geïntegreerd in de reeds bestaande circuits van muizen die zich blijven bezighouden met vrijwillig hardlopen, en dat deze effecten aanhouden zodra muizen zijn gestopt met hardlopen.

Materialen en Methoden

Muizen en Chirurgie

C57BL/6J mannelijke muizen werden gehuisvest op 4-5 dieren per kooi onder standaardomstandigheden. Acht maanden oude (8M) muizen werden geselecteerd omdat, voorbij deze leeftijd, er een sterke afname is in hippocampale neurogenese die de studie van gelabelde neuronen uitsluit (Morgenstern et al., 2008; Trinchero et al., 2017). Muizen werden verdoofd (150 ug ketamine/15 ug xylazine in 10 ul zoutoplossing / g), en retrovirus werd toegediend in het septale gebied van de rechter dentate gyrus (1,5 ul bij 0,15 ul / min) met behulp van steriele gekalibreerde microcapillaire pipetten door stereotaxische chirurgie; coördinaten van bregma (in mm): -2 anteroposterior, -1,5 laterale, en -1,9 ventrale. Op de aangegeven tijdstippen, hersenen werden gefixeerd en secties werden bereid voor confocale beeldvorming (Trinchero et al., 2017). Alleen GC’s van de septale dentate gyrus werden opgenomen in de analyse, die overeenkomt met secties gelokaliseerd van -0,96 tot -2,30 mm van de bregma, volgens de muis hersenen atlas (Paxinos en Franklin, 2001). Experimentele protocollen werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van Fundación Instituto Leloir, volgens de beginselen voor biomedisch onderzoek met dieren van de Raad voor Internationale Organisaties voor Medische Wetenschappen en bepalingen vermeld in de Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.

Running

Loop afstanden werden opgenomen voor elk experiment met behulp van draadloze loopwielen. In de experimenten van figuur 1 dieren werden gehuisvest met een loopwiel voor 7 of 21 dagen, zoals aangegeven. In deze conditie liepen de muizen ∼2 km/dag. In Figuren 2, 3 waarin muizen gedurende 1, 2, of 3 maanden liepen, was de gecontroleerde afstand ∼10 km/dag.

Immunofluorescentie

Immunokleuring werd uitgevoerd op 60-μm vrij zwevende coronale secties. Antilichamen werden aangebracht in tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) met 3% ezelserum en 0,25% Triton X-100. Immunofluorescentie werd uitgevoerd met anti GFP (konijn polyklonaal; 1:500; Invitrogen), anti NeuN (muis monoklonaal; 1:50; een gift van F.H. Gage, Salk Institute for Biological Studies, La Jolla, CA, Verenigde Staten), donkey anti-rabbit Cy3 en donkey anti-muis Cy5 antilichamen (1:250; Jackson Immuno Research Laboratories).

Confocale Microscopie

Voor dendritische lengte metingen, werden beelden verkregen (40×; NA 1,3; olie-immersie) van 60-μm dikke secties nemen Z stacks met inbegrip van 35-50 optische plakjes, airy eenheid = 1 op 0,8-μm intervallen (Trinchero et al, 2017). Dendritische lengte werd vervolgens gemeten met behulp van de LSM Image Browser software van projecties van drie-dimensionale reconstructies op een enkel vlak in GCs uitdrukken GFP. Beelden van GFP gelabelde MFBs in de CA3 regio werden verkregen bij 0,4μm intervallen (63×; NA 1,4; olie-immersie) en een digitale zoom van 6. Gebied en het aantal filopodia werd geanalyseerd uit projecties van drie-dimensionale reconstructies op een enkel vlak. Mossy fiber boutons (MFB) die aan de volgende criteria voldoen werden geselecteerd voor kwantificering: (i) de diameter van de bouton was >drie keer groter dan de diameter van de vezel, (ii) de bouton was verbonden met de mosvezel aan ten minste één uiteinde (Toni et al., 2008). Filopodia werden geïdentificeerd als uitsteeksels die voortvloeien uit grote mossy terminals (1 pm < lengte < 20 pm) (Acsady et al., 1998). Filopodiale uitbreidingen werden gemeten door het tellen van het aantal uitsteeksels per terminal. Voor de beeldregistratie en analyse van morfologische eigenschappen, alle experimentele groepen te bestuderen waren blind voor de operator.

Statistische analyse

Niet anders vermeld, worden de gegevens gepresenteerd als gemiddelde ± SEM. De normaliteit werd beoordeeld met de Shapiro-Wilks test, D’Agostino-Pearson omnibus test, en Kolmogorov-Smirnov test, met een p-waarde van 0,05. Wanneer de gegevens voldeden aan de normaliteitstests (Gaussische verdeling en gelijke variantie), werden ongepaarde t-toetsen met Welch’s correctie of ANOVA met Bonferroni’s post hoc test gebruikt, zoals aangegeven. In gevallen waarin niet aan de normaliteit werd voldaan, werden de volgende niet-parametrische tests gebruikt: Mann-Whitney’s test voor onafhankelijke vergelijkingen, en Kruskal-Wallis test voor meervoudige vergelijkingen.

Resultaten

We hebben eerder aangetoond dat hardlopen de ontwikkeling en functionele integratie van nieuwe GC’s in de verouderende hippocampus versnelt (Trinchero et al., 2017). We hebben nu onderzocht of dit type plasticiteit een aanhoudend niveau van activiteit vereist dat zich in de tijd opstapelt, of dat kortere perioden van hardlopen ook een snellere integratie kunnen triggeren, zoals eerder waargenomen voor de blootstelling aan EE (Trinchero et al., 2019). Om deze vraag te beantwoorden, werden nieuwe neuronale cohorten gelabeld in muizen van middelbare leeftijd (8 maanden oud; 8M) met behulp van een retrovirus dat GFP (RV-GFP) tot expressie brengt. Muizen mochten een loopwiel voor 1 week binnen verschillende vensters van neuronale ontwikkeling, of om te rennen voor het gehele interval van neuronale groei (3 weken; Figuren 1A,B). Zoals eerder beschreven, vertoonden nieuwe GC’s een trage ontwikkeling bij sedentaire muizen, wat resulteerde in korte dendrieten met weinig vertakkingen bij 3 weken. Een week hardlopen veranderde niets aan het algemene uiterlijk van nieuwe GCs in een van de geteste intervallen (Figuren 1C,D). Daarentegen resulteerde hardlopen gedurende het gehele interval van 3 weken in verhoogde dendritische lengte en vertakking, consistent met een versnelde neuronale integratie.

De waargenomen effecten van oefening werden getest op een enkele neuronale cohort, degene die retroviraal gelabeld was. Echter, omdat nieuwe GC voortdurend worden gegenereerd, is het denkbaar dat GC geboren op verschillende momenten binnen de inspanning periode kan ook worden beïnvloed door de activiteit. Om deze hypothese te testen, gebruikten we een eenvoudige strategie om neuronale cohorten geboren op verschillende tijdstippen met betrekking tot inspanningsinitiatie te labelen door muizen bloot te stellen aan loopwielen voor verschillende intervallen, maar altijd het analyseren van neuronale structuur 3 weken na retrovirale injectie (aangeduid als 1m voor de eenvoud). Drie cohorten werden dus vergeleken; een loopt voor 3 weken, gelabeld direct bij het begin van de oefening (Run1m), een loopt voor 2 maanden, gelabeld 1 maand na het begin van de oefening (Run2m), en een loopt 3 maanden, gelabeld 2 maanden na het begin van de oefening (Run3m) (Figuur 2A). We zagen een vergelijkbare mate van neuronale groei in alle omstandigheden in vergelijking met sedentaire muizen, wat aangeeft dat alle neuronale cohorten geboren in de hersenen van een muis van middelbare leeftijd het uitvoeren van vrijwillige hardlopen zal een snelle groei en integratie (Figuren 2B,C) te ondergaan. Dendritische bomen van GC’s in Run3m muizen waren iets langer dan die van Run1m of Run2m muizen, wat suggereert dat de bevordering van neuronale integratie zou kunnen reageren op een mechanisme waarvan het effect zich opstapelt in de tijd. Toch resulteerde 1 maand hardlopen in een bijna maximaal effect op GC-ontwikkeling.

We onderzochten vervolgens de effecten van lichaamsbeweging in de ouder wordende hersenen op neuronale cohorten die ontstonden zodra de activiteit werd beëindigd. We vergeleken hoe het uitvoeren van 3-4 weken beïnvloedt de ontwikkeling van nieuwe GC’s geboren direct bij het begin (Run1m), aan het einde (Run-1m), of 1 maand na het einde van de oefening (Run-2m; figuur 3A). Verrassend, neuronale cohorten geboren aan het begin of aan het einde van de loop periode reageerde op dezelfde manier (Figuren 3B,C). In tegenstelling, cohorten geboren 1 maand na het einde van de oefening (Run-2m) toonde slechts een subtiel effect.

Om volledig te integreren in het circuit, GC’s vestigen glutamaterge excitatoire verbindingen op CA3 piramidale cellen door middel van grote MFBs, en werven GABA-erge feedforward remming op piramidale cellen via filopodiale uitbreidingen die voortvloeien uit deze terminals (Acsady et al., 1998; Toni et al., 2008; Sun et al., 2013; Restivo et al., 2015). Terwijl confocale analyse geen veranderingen onthulde in het gebied van MFBs van neuronen geboren op Run-1m of Run1m in vergelijking met controles, nam het aantal filopodia/MFBs toe met ∼100% (Figuren 3D,E). Deze resultaten wijzen erop dat fysieke inspanning specifiek de connectiviteit van nieuwe GC’s op het remmende lokale netwerk verhoogt (Trinchero et al., 2019).

Discussie

Adulte neurogenese omvat een opeenvolging van complexe ontwikkelingsstappen die resulteert in de integratie van nieuwe informatie-verwerkende eenheden. Neurale stamcellen van de subgranulaire zone verlaten hun rusttoestand om prolifererende neurale progenitorcellen te worden die de precursorpopulatie uitbreiden (transit amplifying cells) (Bonaguidi et al., 2012). Progenitorcellen genereren neuronen die migreren, zich ontwikkelen en integreren in het circuit. Tijdens dit lange tijdsinterval is er een duidelijke vermindering van de neuronale populatie als gevolg van apoptotische celdood. Vrijwillige lichaamsbeweging en EE zijn sterke stimuli voor het stimuleren van volwassen hippocampale neurogenese bij knaagdieren gedurende het hele leven (van Praag et al., 1999a, b; Kronenberg et al., 2003, 2006; Wu et al., 2008; Kannangara et al., 2011). Neurogenese neemt af in de ouder wordende hersenen, voornamelijk als gevolg van de afname van de omvang van de progenitorcelpool. Zowel hardlopen als EE kunnen de verminderde neuronale productie tegengaan die bij ouder wordende dieren wordt vastgesteld, en wel via verschillende mechanismen (Kempermann et al., 2010). Hardlopen werkt op twee niveaus om neurogenese te verbeteren: het verhogen van de snelheid van proliferatie van neurale progenitorcellen (van Praag et al., 1999b, 2005; Cooper et al., 2018), en het versnellen van de rijping en functionele integratie van zich ontwikkelende neuronen (Trinchero et al., 2017). EE verhoogt de overleving en versnelt ook de rijping van nieuwe GC’s, maar beïnvloedt de proliferatie niet (Trinchero et al., 2017, 2019).

Running bevordert ook de herbedrading van neuronale connectiviteit en modulatie van intrinsieke eigenschappen in nieuwe GC’s tijdens de eerste week van ontwikkeling in jong-volwassen muizen (Sah et al., 2017). We hebben onlangs een kritieke periode gemeld tijdens de tweede week van de rijping van GC’s in ouder wordende dieren, waarin EE dendritische groei en snellere integratie van nieuwe neuronen in het circuit induceert (Trinchero et al., 2019). We vroegen hier of hardlopen gedurende 1 week op elk moment van de ontwikkeling van GC’s hun integratie zou beïnvloeden, maar vonden geen effect (figuur 1). De gehele hardloopperiode van 3 weken was nodig om neurogenese te reguleren. Het gebrek aan modulatie op korte termijn suggereert een mechanisme gemedieerd door factoren die moeten worden opgebouwd om merkbare veranderingen uit te oefenen. Interessant is dat vrijwillige lichaamsbeweging de productie van BDNF verergert, die zich gedurende weken opstapelt voordat een plateauniveau wordt bereikt dat maximale acties uitoefent (Vecchio et al., 2018). Hoewel neurotrofines belangrijke mediatoren zijn, is het aannemelijk dat de hier waargenomen effecten door meerdere mechanismen worden gemedieerd. Oefening verhoogt ook de elektrische activiteit in de dentate gyrus, verhoogt de bloedstroom, en moduleert neuro-inflammatie (Piatti et al., 2011; Speisman et al., 2013; Trinchero et al., 2017). De bijdrage van andere mechanismen vereist verdere studies.

We laten hier zien dat ∼3 weken oude GC’s van ouder wordende muizen die chronisch zijn blootgesteld aan een loopwiel (tot 3 maanden) een volledig ontwikkeld fenotype presenteren met lange en complexe dendritische arborizaties, vergelijkbaar met die van nieuwe GC’s gegenereerd in jongvolwassen muizen (figuur 2). Volwassen GCs in jong-volwassen muizen en muizen van middelbare leeftijd bereiken gelijkwaardige dendritische lengte en complexiteit tegen het einde van de ontwikkeling, vergelijkbaar met 3 weken oude GCs in ouder wordende muizen blootgesteld aan EE of hardlopen (Piatti et al., 2011; Trinchero et al., 2017, 2019). Dit geaccumuleerde bewijs spreekt voor een duidelijke versnelling van de snelheid van rijping opgeroepen door running.

Op het niveau van neuronale output, bevorderde running de snelle groei van filopodiale extensies, maar wijzigde de grootte van MBFs niet (Figuren 3D,E). Dit resultaat suggereert dat nieuwe GC’s snel integreren, maar hun output zou kunnen worden bevooroordeeld in de richting van de activering van GABA-erge interneuronen in CA3 (gecontacteerd door filopodia), in plaats van piramidale cellen gecontacteerd door MFB’s (Acsady et al., 1998; Toni et al., 2008; Sun et al., 2013; Restivo et al., 2015). Het is verrassend dat EE een duidelijke toename van zowel de grootte van MFBs als het aantal filopodiale extensies in ouder wordende muizen uitlokte, consistent met een meer gebalanceerde modulatie van neuronale output (Trinchero et al., 2019). Wij speculeren dat veranderingen als gevolg van EE activiteit-afhankelijke hermodellering van specifieke synapsen inhouden die versterkt worden voor het coderen van ruimtelijke signalen (Nicoll en Schmitz, 2005; Holtmaat en Svoboda, 2009). Daarentegen kan hardlopen een algemene stimulans zijn voor nieuwe GC’s om zich voor te bereiden om verbinding te maken met specifieke doelen wanneer coderen noodzakelijk wordt, met behoud van de remmende toon van GABA-erge interneuronen die zou kunnen fungeren als een mechanisme dat postsynaptische activiteit beperkt totdat de nieuwe GC goed is geassembleerd binnen het omringende netwerk.

Onze resultaten geven aan dat de ouder wordende hersenen neurogene signalen genereren wanneer muizen gedurende langere perioden (maanden) blijven hardlopen. In deze context zal de daaropvolgende neuronale cohorten geboren in lopende muizen te ontwikkelen en te integreren snel, waardoor veroudering circuits accumuleren aanzienlijke aantallen nieuwe neuronen (figuur 4). De voortdurende opname van nieuwe GC met kenmerken die lijken op wat er gebeurt in jongere muizen resulteert in een verjongde hippocampus met neuronen die kunnen worden klaargestoomd om te reageren op toekomstige ervaringen.

In een breder perspectief gaat de toename van de levensduur die met de moderne samenleving gepaard gaat, gepaard met een hoger risico op cognitieve achteruitgang. Het wordt dus relevant om de mechanismen te begrijpen die ten grondslag liggen aan de welbekende voordelen van lichaamsbeweging voor de hersenfunctie. Bovendien zouden er op de lange termijn verschillen kunnen zijn tussen individuen die gedurende verschillende intervallen in het leven aan lichaamsbeweging doen en degenen die continu aan lichaamsbeweging hebben gedaan, wat betreft het verminderen van het risico op het ontwikkelen van neurodegeneratieve ziekten (Llorens-Martin, 2018). Onze resultaten tonen aan dat continu hardlopen de integratie van vele neuronale cohorten bevordert, waardoor de complexiteit van het netwerk op een opmerkelijke manier wordt verhoogd. Het ontwerpen van verschillende strategieën voor het verhogen van de effectiviteit van nieuwe neuron integratie in de hippocampus zou kunnen dienen als een veelbelovend mechanisme van plasticiteit om uiteindelijk de cognitieve achteruitgang die optreedt in de gezonde en zieke verouderende hersenen te verbeteren. Ten slotte zal het ontleden van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de verschillende aspecten van dergelijke versnelde neuronale integratie en ontwikkeling ons veel leren over het potentieel voor plasticiteit van neurale netwerken in het ouder wordende brein.

Data Availability

De gegevens die de bevindingen van deze studie ondersteunen, zijn op redelijk verzoek beschikbaar bij de corresponderende auteur.

Ethics Statement

De dierstudie werd beoordeeld en goedgekeurd door commissie voor het gebruik en de verzorging van proefdieren van het Leloir Instituut.

Author Contributions

MT en MH voerden de experimenten uit en analyseerden de gegevens. MT, MH, en AS ontwierpen de experimenten en schreven het manuscript. AS zorgde voor financiële ondersteuning.

Funding

Dit werk werd ondersteund door het Argentijnse Agentschap voor de bevordering van wetenschap en technologie (Grant# PICT2015-3814), het National Institute of Neurological Disorders and Stroke, en het Fogarty International Center (Grant# R01NS103758) aan AS, die onderzoeker is in de Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET). MT werd ondersteund door een CONICET fellowship.

Conflict of Interest Statement

De auteurs verklaren dat het onderzoek werd uitgevoerd in de afwezigheid van enige commerciële of financiële relaties die kunnen worden opgevat als een potentieel belangenconflict.

Acknowledgments

Wij danken de leden van het AS lab voor inzichtelijke discussies.