Deuterated Chloroform
13.4.4 Valutare e mantenere le prestazioni dello strumento
L’incorporazione degli strumenti di laboratorio nei sistemi di gestione della qualità utilizzati per le certificazioni di laboratorio (ad esempio, ISO17025 per i laboratori di analisi) richiede la valutazione e il mantenimento delle prestazioni dello strumento a intervalli regolari. Queste certificazioni permettono allo scienziato analista di laboratorio di creare test di qualificazione delle operazioni (OQ) e delle prestazioni (PQ) intorno all’uso previsto dello strumento. Così, per l’NMR i test OQ/PQ possono variare a seconda dei test analitici comuni da eseguire sullo strumento. Gli strumenti moderni hanno procedure automatiche che richiedono all’utente di inserire il campione appropriato, poi una serie di test viene eseguita in modo automatico. Alla fine di questi test, viene emesso un rapporto che permette all’utente di valutare le prestazioni complessive dello spettrometro.
Per testare le proteine terapeutiche in soluzioni acquose questi test OQ dovrebbero includere: calibrazione della temperatura, linehape sul segnale dell’acetone in cloroformio deuterato, sensibilità sui segnali di etilbenzene in cloroformio deuterato e/o soppressione dell’acqua con valutazione della sensibilità sui protoni anomeri di una soluzione di saccarosio 2 mM. La calibrazione della temperatura è importante perché la dinamica di una proteina è influenzata dalle condizioni ambientali della soluzione, che possono avere grandi effetti sulle larghezze di linea e frequenze del segnale osservato. La regolazione della temperatura del campione negli spettrometri NMR si basa su un attento controllo della temperatura dell’aria della sonda e della portata. L’impatto dell’aria della sonda sulla temperatura del campione può essere misurato misurando gli spostamenti chimici di una soluzione 100% metanolo o 100% glicole etilenico. Questi spostamenti sono stati accuratamente misurati in modo che la temperatura effettiva del campione può essere valutata con una data temperatura dell’aria della sonda e impostazione della velocità di flusso.
L’impatto di avere un buon campione shimming (cioè, un campo magnetico uniforme attraverso la parte osservata di un campione) sulla qualità spettrale non può essere sopravvalutato: il più stretto i picchi, meglio la risoluzione e la sensibilità dei segnali da misurare. In particolare, se si utilizzano tecniche di soppressione del segnale, più stretta è la base del picco da sopprimere, meglio funzioneranno le tecniche di presaturazione o di soppressione selettiva del segnale a banda stretta. Fortunatamente, l’avvento delle tecniche di mappatura del campo e dello shimming del gradiente ha semplificato questo compito, spesso dispendioso in termini di tempo, di regolare le impostazioni dello shim per ogni campione. Tuttavia, ci saranno campioni per i quali le mappe shim non funzionerà bene, e il tempo dovrà essere speso sulla regolazione shim per ottenere la risposta ottimale strumento.
La valutazione della sensibilità dello spettrometro con campioni standard è un modo ideale per monitorare le prestazioni del sistema e i valori ottenuti dai test standard devono soddisfare o superare le specifiche dello spettrometro impostato dal produttore. Da notare, le specifiche dello spettrometro sono spesso impostate in modo conservativo dal produttore per assicurare che il loro strumento passa questi test all’installazione. Tuttavia, eseguire i test OQ/PQ a intervalli regolari permette al proprietario dello spettrometro di acquisire familiarità con le capacità del loro particolare strumento. Le deviazioni dall’insieme dei valori stabiliti dai test di routine dovrebbero essere esaminate attentamente perché potrebbero essere un’indicazione di malfunzionamento dello strumento.
Nel caso dell’analisi di piccole molecole in solventi organici, l’uso del segnale dell’acetone in cloroformio deuterato per ottenere non solo una forma delle linee di Lorentzian e una FWHH stretta ma una base stretta (ad esempio, <20 Hz al 20% del segnale del satellite 13C) porta solitamente alla migliore sensibilità sui segnali dell’etilbenzene in cloroformio deuterato. Per gli spettrometri utilizzati per ottenere spettri in soluzioni acquose, una seconda misura della sensibilità è più importante: la capacità dello spettrometro di ottenere una buona sensibilità e risoluzione dai segnali vicino al picco dell’acqua. Così, la misura della sensibilità con i segnali protonici anomerici da uno standard composto da 2 mM di saccarosio in soluzione 95% H2O/5% D2O con la soppressione dell’acqua applicata è una misura più realistica delle prestazioni segnale-rumore dello spettrometro per NMR di campioni terapeutici proteici.
Per una PQ su uno spettrometro che valuta la qualità delle proteine terapeutiche, un attributo critico di qualità di questi farmaci è una specifica struttura terziaria impartita dal ripiegamento della catena di aminoacidi. Pertanto, come un PQ su uno spettrometro che esegue analisi 2D-structure map, 2D-HSQC spettri possono essere eseguiti in un breve periodo di tempo su un 15N o 13C-isotopicamente arricchito campione per stabilire la capacità dello spettrometro di eseguire programmi di impulsi con schemi di disaccoppiamento efficiente e selezione coerenza gradiente. 13C o 15N isotopicamente arricchito proteina (ad esempio, SH3-domain protein o ubiquitina) soluzioni standard in tubi sigillati sono disponibili in commercio a concentrazioni che consentono di raccogliere dati in poche ore. Spettrometri opportunamente calibrati a 500 MHz e oltre, e dotati di una criosonda possono misurare mappe di struttura 2D a proteine di abbondanza naturale (cioè, non isotopicamente arricchite) a ∼1,0 mM concentrazione in 2-3 giorni di tempo spettrometro.