Diagnosi di C. diff contro rilevazione: Perché i test rimangono ambigui
Clostridioides difficile è la causa più comune di diarrea infettiva nelle strutture sanitarie, e i dati del sistema di sorveglianza Emerging Infections Program del CDC nel 2011 stimano che abbia causato quasi mezzo milione di infezioni e 29.000 morti entro 30 giorni dalla diagnosi. Ci sono una moltitudine di test disponibili per la diagnosi di infezione da Clostridioides difficile (CDI) – che rilevano l’acido nucleico, l’enzima e/o le tossine specifiche del C. difficile, in varie combinazioni e algoritmi – e questo ha portato a una significativa confusione riguardo all’interpretazione clinica e alla distinzione tra colonizzazione e vera infezione.
L’Infectious Diseases Society of America (IDSA) ha recentemente pubblicato linee guida aggiornate sulla pratica clinica della CDI, comprese le raccomandazioni per i test. Queste raccomandazioni affermano che la popolazione preferita per il test CDI include pazienti con diarrea inspiegabile e di nuova insorgenza che consiste in ≥3 feci non formate in 24 ore. Per le istituzioni in cui non ci sono criteri istituzionali preconcordati per la presentazione delle feci dei pazienti, il metodo migliore determinato dai valori predittivi positivi e negativi era un test delle tossine delle feci come parte di un algoritmo a 2 o 3 fasi piuttosto che un test di amplificazione dell’acido nucleico (NAAT) da solo. Citano 2 metodi comuni: 1) uso di glutammato deidrogenasi più test della tossina arbitrato da test di amplificazione dell’acido nucleico (NAAT) o 2) NAAT più test della tossina. Questa raccomandazione, tuttavia, è valutata come “debole” con una “bassa qualità delle prove”. Il panel sottolinea che in realtà il metodo di diagnosi più sensibile è un NAAT da solo o un algoritmo multistep, che dovrebbe essere usato quando ci sono criteri istituzionali pre-concordati per la presentazione delle feci.
Queste raccomandazioni riflettono la continua mancanza di consenso riguardo alle strategie ottimali per la diagnosi di CDI. Le raccomandazioni variano ulteriormente quando si considerano quelle al di fuori degli Stati Uniti: Le linee guida europee danno la priorità al rilevamento della tossina e pongono meno enfasi sul NAAT o sugli algoritmi multistep.
Strategie diagnostiche e limitazioni
Rilevamento della tossina e cultura: Storicamente, il gold standard di laboratorio è stato la coltura tossicologica in cui il C. difficile viene messo in coltura dalle feci e gli isolati vengono testati per la loro capacità di produrre tossina; i filtri delle feci possono anche essere testati direttamente per la tossina attraverso un test di citotossicità cellulare (CCNA) come metodo di riferimento alternativo. Questi metodi richiedono diversi giorni e sono quindi inadatti ai test di laboratorio di routine. Un grande studio condotto nel Regno Unito ha confrontato la coltura tossicologica con il test di citotossicità su più di 12.000 campioni e ha correlato i risultati con i dati clinici. Mentre hanno trovato che i risultati positivi del test di citotossicità erano correlati a una maggiore mortalità, le colture tossigene positive con test di tossicità negativi non lo erano, implicando così che il rilevamento della tossina era fondamentale per la diagnosi clinica della CDI. Il rilevamento della tossina tramite test immunoenzimatici qualitativi (EIA) è stato un pilastro della diagnosi, tuttavia, questi test hanno limitazioni significative nella sensibilità rispetto alla coltura tossigena (52-75%), anche se hanno una maggiore specificità (96-98%) rispetto alla coltura. Ci sono una varietà di opzioni commerciali di laboratorio disponibili per il test CDI che sono ben descritte in recensioni recenti.
Rilevamento della glutammato deidrogenasi: I test immunologici del glutammato deidrogenasi (GDH) e altri test molecolari si sono evoluti per affrontare la scarsa sensibilità tra le tossine EIA. I test immunologici GDH rilevano l’enzima metabolico altamente conservato presente in tutti gli isolati di C. difficile. Tuttavia, questo antigene è presente sia nei ceppi tossigeni che in quelli non tossigeni di C. difficile e, di conseguenza, il test GDH può essere solo una fase di screening in un algoritmo a 2 o 3 fasi prima di un test più specifico sulla tossina e/o un test molecolare per il rilevamento del gene della tossina.
NAAT: sebbene i NAAT siano stati utilizzati in ambienti di ricerca sin dai primi anni ’90, la prima piattaforma approvata dalla Food and Drug Administration statunitense non è stata disponibile fino al 2009. Attualmente sono disponibili almeno 12 piattaforme commerciali che rilevano obiettivi genici tra cui tcdA (gene della tossina A), tcdB (gene della tossina B) e RNA ribosomiale 16S (rRNA). I saggi sono più sensibili della tossina EIA ed eventualmente GDH EIA, ma meno sensibili della coltura tossigena.
Test multistep basati su algoritmi e rilevamento ultrasensibile della tossina: La complessità del mondo dei test CDI è ulteriormente confusa da dati contrastanti sul miglior approccio algoritmico alla diagnosi. Gli scienziati in uno studio di coorte prospettico monocentrico hanno confrontato la necessità di trattamento e la storia naturale dei pazienti che erano tossina-EIA-positivi/PCR positivi (131 pazienti) con pazienti tossina-EIA-negativi/PCR positivi (162) e tossina-EIA-negativi/PCR negativi (1123). Hanno trovato che i pazienti tossina-positivi/PCR-positivi avevano più diarrea e complicazioni legate alla CDI, mentre i gruppi di pazienti tossina-negativi/PCR positivi e tossina-negativi/PCR-negativi avevano tassi simili di complicazioni gastrointestinali rispetto agli altri (7,6% contro 0% contro 0,3%; p <0,001). Ci sono stati 11 decessi legati alla CDI tra il gruppo tossina-positivo/PCR-positivo, un decesso nella coorte tossina-negativa/PCR-positivo, e nessun decesso tra il gruppo tossina-negativo/PCR-negativo. I ricercatori hanno quindi concluso che il solo test della tossina può essere sufficiente per la diagnosi di CDI e l’uso dei soli test NAAT può portare a una sovradiagnosi e a un trattamento eccessivo. Tuttavia, il test NAAT e l’identificazione del trasporto asintomatico sono rilevanti per il controllo delle infezioni e per scopi epidemiologici.
In realtà, un altro gruppo di ricerca ha riferito che l’assenza di tossina nelle feci può non essere predittiva della gravità della CDI e quindi i risultati NAAT-positivi, EIA-negativi sono ancora clinicamente significativi. I ricercatori hanno raccomandato che la NAAT dovrebbe essere usata come metodo diagnostico primario per la CDI, anche se non hanno specificato un approccio algoritmico diagnostico preferito. In questo studio sono stati arruolati 296 pazienti con 143 classificati come veri CDI basati su più metodi diversi. Non hanno trovato alcuna differenza nella positività alla tossina EIA tra i pazienti con malattia lieve vs. grave (49% vs. 58%, p = 0,31). Il rilevamento della tossina EIA, tuttavia, è limitato da un limite di rilevamento relativamente poco sensibile. I limiti di rilevamento analitico più performanti per gli EIA sono compresi tra 0,8-2,5 ng/ml, mentre per i saggi di citotossicità basati sulle cellule le concentrazioni di tossine sono state calcolate in alcuni scenari fino a 30 pg/ml. Studi più recenti si sono quindi chiesti se la rilevazione ultrasensibile delle tossine possa in effetti differenziare meglio la colonizzazione dalla vera infezione con l’ipotesi che la colonizzazione avrebbe livelli più bassi di tossina.
Questa ipotesi è stata testata in un recente studio prospettico monocentrico che ha esaminato le prestazioni di un test ultrasensibile per la rilevazione e la quantificazione delle tossine di C. difficile utilizzando la tecnologia Simoa (single molecule array) capace di un cutoff analitico di circa 1pg/ml e un cutoff clinico di circa 20 pg/ml. I ricercatori hanno confrontato le concentrazioni di tossine nei pazienti CDI NAAT-positivi (n=122) definiti come quelli che avevano ≥3 feci non formate durante le 24 ore prima della raccolta delle feci o diarrea persistente nelle note cliniche rispetto ai portatori asintomatici che erano NAAT positivi (n=44) ma che non avevano rapporti di diarrea durante le 48 ore precedenti la raccolta delle feci. Gli scienziati sono stati sorpresi di scoprire che la concentrazione di tossina A e B nelle feci non poteva distinguere un paziente con CDI da un portatore asintomatico. La concentrazione mediana di tossina A, tossina B e tossina A+B e i valori di soglia del ciclo NAAT (Ct) nei due gruppi erano infatti simili. Le frequenze di concentrazioni di tossina A+B ≥ 20pg/ml (cutoff clinico) erano comparabili tra i gruppi CDI-NAAT+ (65%) vs. carrier-NAAT+ (77%). Hanno notato, tuttavia, che se hanno definito i gruppi CDI e carrier non solo in base alla positività NAAT ma anche alla positività alla tossina (dove la tossina A + B ≥ 20 pg/ml), allora c’erano differenze significative nelle concentrazioni mediane di tossina (concentrazioni mediane di tossina A, B, e A+B) e nei valori Ct. Di conseguenza, mentre lo studio ha osservato che i pazienti con livelli molto bassi di tossina potrebbero ancora avere una diarrea significativa coerente con la CDI e viceversa i pazienti asintomatici potrebbero avere quantità significative di tossina rilevata, sopra una soglia di cutoff per la tossina i pazienti asintomatici hanno avuto concentrazioni inferiori di tossina rilevata.
In sintesi, la rilevazione ultrasensibile della tossina non sembra essere la risposta del Santo Graal a come diagnosticare più efficacemente la CDI e distinguere la malattia dalla colonizzazione. I risultati sorprendenti di questo studio sollevano la questione centrale del perché i pazienti con alti livelli di tossina nelle loro feci possono essere asintomatici e al contrario i pazienti con livelli molto bassi di tossina possono essere sintomatici. Alcuni esperti ipotizzano che i fattori dell’ospite, come gli anticorpi antitossina, possono spiegare perché i pazienti possono essere asintomatici nonostante la presenza di tossine di C. difficile nelle feci. Può essere che un test che rilevi tali anticorpi o altri biomarcatori dell’ospite, oltre alla rilevazione del patogeno, possa essere necessario per una migliore diagnosi di CDI. Mentre attendiamo con ansia ulteriori ricerche sulla diagnostica della CDI, rimaniamo in un’area familiare della medicina clinica in cui i test forniscono prove di supporto ma non definitive di una diagnosi, e dobbiamo essere consapevoli delle loro limitazioni intrinseche.
Quanto sopra rappresenta il punto di vista dell’autore e non riflette necessariamente l’opinione dell’American Society for Microbiology.