Evoluzione del Vibrio cholerae tossigeno e creazione di serbatoi negli ecosistemi acquatici
Risultati
Quattro dipartimenti – Artibonite, Centre, Nord-Ouest e Ouest – rappresentano il 90% dei casi di colera riportati ad Haiti (9). Abbiamo concentrato i nostri sforzi sul dipartimento Ouest (Fig. 1A), una regione costiera ricca di ecosistemi acquatici dove abbiamo isolato V. cholerae O1 tossigeno da siti fluviali ed estuarini fissi (Fig. 1A). La prevalenza del V. cholerae O1 tossigeno acquatico era correlata all’aumento della temperatura e delle precipitazioni, ma non alla conta dei coliformi fecali, suggerendo che la presenza non era dovuta solo alla contaminazione fecale (10). I conteggi mensili dei casi a Ouest, che oscillano annualmente ma diminuiscono durante la stagione secca e aumentano durante la stagione delle piogge (da aprile a ottobre), sono correlati all’aumento della temperatura e delle precipitazioni (Fig. 1B). Questo è in accordo con i modelli di V. cholerae O1 endemico in Bangladesh e Perù, dove le epidemie stagionali di colera sono correlate con l’aumento di V. cholerae O1 nell’ambiente e l’aumento della temperatura dell’acqua o delle precipitazioni (11, 12).
Per distinguere tra evoluzione sotto pressione selettiva (adattamento) o deriva genetica, abbiamo calcolato il rapporto tra tasso di sostituzione non sinonima (dN) e sinonima (dS) (dN/dS) (Appendice SI, Fig. S6 e Tabella S5). La dinamica evolutiva degli isolati clinici è stata guidata principalmente dalla selezione purificante (dN/dS = 0,6, P < 0,001), coerente con una D di Tajima negativa (-2,3, P < 0,005) e una popolazione che sperimenta colli di bottiglia e/o spazzate selettive. Ci si aspetta che la selezione negativa guidi l’epidemia già stabilita negli esseri umani che ha raggiunto un picco nel paesaggio adattivo durante una fase epidemica iniziale guidata dalla selezione diversificante (14). Al contrario, gli isolati ambientali hanno mostrato maggiori tassi nonsinonimi (dN/dS = 2.1, P < 0.001), caratteristica di una popolazione microbica eterogenea recentemente introdotta in un nuovo ambiente e in fase di fissazione della nuova selezione diversificante guidata dalla variante. Infatti, abbiamo trovato impronte molecolari ambiente-specifiche nei genomi di V. cholerae che hanno replicato con successo e persistito nell’ambiente acquatico. Un totale di sette mutazioni non sinonime in regioni codificanti, potenzialmente in grado di garantire un vantaggio selettivo alla popolazione ambientale di V. cholerae, sono emerse lungo la spina dorsale della filogenesi degli isolati ambientali tra il 2012 e il 2015 (Fig. 3 e Appendice SI, Tabella S7). Tre mutazioni specifiche per l’ambiente, due all’inizio della biforcazione della spina dorsale (Fig. 3) e una in un ramo interno (Appendice SI, Tabella S7), hanno interessato i geni del sistema di secrezione di tipo II (TSSII): proteine A e G della via di secrezione generale e K (Appendice SI, Tabella S7). Il TSSII gioca un ruolo fondamentale nella virulenza e nella sopravvivenza di V. cholerae in diverse nicchie, come i serbatoi acquatici o gli ospiti umani (26). Altre mutazioni trovate lungo i rami interni hanno interessato i geni relativi alla risposta allo stress ambientale, alla chemiotassi/motilità di V. cholerae in risposta a spunti ambientali fluttuanti, al controllo della lunghezza dell’uncino del flagello, alla formazione di biofilm nell’ambiente extraintestinale e alla crescita esponenziale in risposta ai nutrienti disponibili (Appendice SI, Fig. S7 e Tabella S7). Gli isolati ambientali che hanno contribuito con successo alla stirpe ambientale in evoluzione sono stati raccolti non solo vicino agli ospedali e ai centri di trattamento del colera situati a Gressier ma anche nelle vicine regioni di Goave e Carrefour (Fig. 3).
Evoluzione e adattamento di V. cholerae nei serbatoi acquatici di Haiti. Relazione filogenetica e distribuzione geografica di 27 isolati ambientali raccolti tra il 2012 e il 2015 ad Haiti. Le mutazioni non sinonime acquisite durante l’evoluzione della popolazione ambientale, ricostruite dall’inferenza bayesiana degli stati ancestrali, sono indicate lungo la spina dorsale dell’albero. Gli SNPs rilevati lungo il tronco (lignaggio superstite) dell’albero sono stati numerati in sequenza da 1 a 7 per facilitare il confronto con le informazioni aggiuntive riportate in Appendice SI, Tabella S7. Le mappe mostrano i siti di campionamento, raggruppati per fonte acquatica, etichettati con punti gialli, rossi, arancioni e ciano nella regione di Gressier, viola per Carrefour, e blu nella regione di Jacmel.
L’evidenza delle forze evolutive epidemiologiche e ambientali che guidano l’epidemia di Haiti ci ha motivato a considerare un modello dinamico di trasmissione del colera di tracciamento e genetica della popolazione attraverso ambienti e ospiti acquatici. Come nei precedenti modelli di colera del nostro gruppo (27), il nostro modello epidemiologico di base si basa sul quadro SIRW (susceptible-infected-recovered with reservoir), un’estensione del classico quadro SIR (susceptible-infected-recovered) con un compartimento aggiunto per la concentrazione del patogeno in un serbatoio acquatico (W) (Fig. 4 e Appendice SI, Figg. S8 e S9). In linea con Kirpich et al. (27), abbiamo permesso la replicazione al di fuori dell’ospite, insieme alla stagionalità nella trasmissione ambientale, lo spargimento e il decadimento, come suggerito dalla significativa correlazione nel conteggio dei casi con le precipitazioni. Oltre a questa formulazione epidemiologica, abbiamo considerato una componente evolutiva nel nostro modello. Sia la deriva neutrale che le pressioni di selezione sono tenute in considerazione nel nostro quadro multilocus, dove misuriamo Ne calcolando la diversità genetica e utilizzando approcci coalescenti (Appendice SI, testo). Coerentemente con altri studi, abbiamo assunto un compromesso tra sopravvivenza ambientale e fitness nella trasmissione dell’ospite per i loci sotto selezione. I risultati delle simulazioni del modello ricapitolano le caratteristiche qualitative dei conteggi dei casi Ne e mensili (Fig. 4A e Appendice SI, Fig. S8).
Modello di trasmissione mista del colera e previsione di vaccinazione. (A) Ne (dimensione effettiva della popolazione) osservata dai dati (grigio) e nella simulazione con replica ambientale (verde) e Ne nella simulazione senza replica ambientale (viola). (B) Scenari distinti di vaccinazione e controllo per la simulazione del modello con replicazione ambientale, in particolare coperture di vaccinazione del 64% (tasso di 0,01 d-1), 88% (tasso 0,04 d-1), e 64% con un aumento del 10% del tasso di decadimento ambientale. Qui definiamo la copertura della vaccinazione come la riduzione percentuale degli individui suscettibili (al raggiungimento di uno stato stazionario approssimativo dopo 2 o 3 mesi di vaccinazione). Al contrario di Kirpich et al. (27) e delle simulazioni senza replicazione ambientale (Appendice SI, Fig. S10) in cui il 64% di copertura vaccinale sradica il patogeno entro un anno, qui è necessaria più vaccinazione (88% di copertura) o un aumento del decadimento ambientale (aumento del 10%) per controllare il colera in presenza di replicazione ambientale.
Prima, l’output del modello e i dati mostrano entrambi un aumento e un calo di Ne inizialmente che riflette una rapida espansione seguita da una selezione negativa dopo il focolaio iniziale (Fig. 4A). Poi è arrivata l’osservazione di una seconda crescita in Ne nel 2013, più grande in estensione di quanto ci si aspetterebbe dalla sola trasmissione dell’ospite, prodotta da una precedente esplosione stagionale e che si estende in un periodo di riduzione dell’incidenza. La nostra ipotesi di diversificazione all’interno del serbatoio acquatico offre una spiegazione per questa impennata relativa in Ne, ed è supportata da simulazioni di modelli ragionevoli in cui l’inclusione della replicazione ambientale permette questa esplorazione evolutiva in contrasto con i casi senza replicazione ambientale (Fig. 4A e Appendice SI, Fig. S8). In particolare, durante la fine 2012-metà 2013 picco, uuSNPs sono stati rilevati nei seguenti geni del lignaggio ambientale superstite: Vch1786_I0012 (1 C→T), Vch1786_I0051 gene (3 C→T), Vch1786_I0998 (30 G→A), Vch1786_I1539 (44 A→G), rseA (52 G→A), epsG (61 A→C), e Vch1786_II0794 (107 C→A) (Appendice SI, Fig. S3). Le mutazioni in questi geni possono aver contribuito ad un maggiore adattamento dei ceppi ambientali nell’ecosistema acquatico, anche se saranno necessari futuri studi in vitro per indagare il loro contributo alla fitness di V. cholerae. Il picco nella replicazione ambientale è seguito da un sostanziale declino in Ne che inizia prima del grande periodo di stasi nel 2014. Ancora una volta, l’incidenza dei casi non spiega completamente l’entità di questo calo. Mentre il collo di bottiglia della popolazione induce una diminuzione di Ne, le simulazioni suggeriscono che la replicazione ambientale è necessaria per accelerare la fissazione dei geni adattati a persistere nel serbatoio acquatico. Alla fine del 2014, i serbatoi ambientali si riversano sugli ospiti con un picco di casi clinici, possibilmente potenziati da un adattamento benefico dell’ospite e/o dalla perdita di immunità nella popolazione ospite. Ampie simulazioni calibrate sui dati dei casi suggeriscono che per adattarsi ulteriormente al Ne osservato, la replicazione ambientale dovrebbe essere inclusa nel modello. Una ramificazione importante dei nostri risultati è che la replicazione e l’adattamento all’interno del serbatoio acquatico possono rendere più difficili le strategie di controllo mirate alla trasmissione dell’ospite. Infatti, proiettando in avanti dal 2015 nelle simulazioni, abbiamo osservato che la vaccinazione può facilmente eliminare il patogeno in assenza di replicazione ambientale (Appendice SI, Fig. S10). Tuttavia, per l’adattamento ambientale e la replicazione coerente con il Ne osservato, vaccinare una porzione molto più grande della popolazione o aggiungere un intervento che colpisce il serbatoio acquatico è necessario per eliminare il colera nel nostro modello dinamico a trasmissione mista (Fig. 4B).