I neutrofili trasmigrati nel lume intestinale impegnano ICAM-1 per regolare la barriera epiteliale e il reclutamento dei neutrofili

I neutrofili trasmigrati nel lume intestinale impegnano ICAM-1 per regolare la barriera epiteliale e il reclutamento dei neutrofili

ICAM-1 promuove l’adesione e la locomozione dei PMN sulla membrana epiteliale apicale in condizioni di infiammazione

Negli ascessi della cripta, come si osserva nelle IBD attive, i PMN che infiltrano le cripte intestinali sono spesso osservati in intimo contatto con la superficie epiteliale apicale (luminale).14 Per esaminare PMN-IEC interazioni durante le fasi finali di TEM, abbiamo modellato PMN migrazione attraverso l’epitelio intestinale in condizioni infiammatorie utilizzando un setup precedentemente descritto transwell.19 PMN TEM nella direzione fisiologica basolaterale-to-apicale attraverso controllo o interferone-γ (IFNγ) – trattati T84 IECs è stato indotto con l’aggiunta di un transepiteliale N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLF) gradiente (100 nM). L’esposizione di T84 IECs a IFNγ (100 U ml-1, 24 h) non ha avuto alcun effetto significativo sulla funzione di barriera IEC o l’espressione e la localizzazione subcellulare delle proteine chiave giunzionale JAM-A, Occludin, e ZO-1 (Figura supplementare S1 online). IFNγ trattamento non ha avuto alcun effetto significativo sul numero di PMN che ha completato TEM, tuttavia, ha aumentato significativamente il numero di PMN apicalmente associato (da 8.7±1.8%, non trattata, al 19.7±1.9%, IFNγ, apicale, Figura 1a). Coerentemente con questo aumento, il numero di PMN non migrati (PMN nella camera superiore, basale) è stato significativamente ridotto (∼1.5 volte) dopo il trattamento IFNγ, suggerendo un aumento del tasso di migrazione (Figura 1a). Il numero di PMN all’interno del monostrato epiteliale (epith) non è stato modificato. Rappresentante immagini di immunofluorescenza confocale (Figura 1b, pannelli superiori) e z-proiezioni (pannelli inferiori) mostrano PMN apicalmente associati dopo la migrazione attraverso IFNγ stimolato, ma non controllo T84 monostrati. Come IFNγ è stato precedentemente dimostrato di indurre l’espressione ICAM-1 in epitelio infiammato,27 abbiamo ipotizzato che durante l’infiammazione, PMN che migrano attraverso monostrati epiteliali rimasti aderenti alla membrana apicale attraverso Mac-1- e ICAM-1-dipendente interazioni, e quindi sarebbe in grado di ICAM-1-dipendente locomozione come è stato precedentemente osservato in endotelio vascolare.24, 28 Confermando i risultati precedenti, il trattamento IFNγ (100 U ml-1, 24 h) ha indotto un robusto, tempo-dipendente aumento dell’espressione ICAM-1 (picco 24 h dopo il trattamento, Figura 1c,d) sulla membrana apicale di T84 IECs (Figura 1e). Questo effetto era specifico per IFNγ, come l’esposizione di T84 e SKCO15 IECs al fattore di necrosi tumorale-α (TNFα; 10 ng ml-1) non è riuscito a indurre l’espressione ICAM-1 (Figura supplementare S2A, B). L’upregolazione di ICAM-1 è stata osservata anche nell’epitelio della cripta delle biopsie del colon di pazienti con colite ulcerosa attiva rispetto alla mucosa sana (Figura 1f). Inoltre, confermando ICAM-1- e Mac-1-dipendente adesione PMN alle membrane apicali IEC, l’aggiunta di entrambi anti-ICAM-1 o anti-Mac-1 funzione di blocco degli anticorpi (Abs; 20 μg ml-1) invertito l’IFNγ-indotto aumento di adesione PMN (Figura supplementare S3A). È interessante notare che l’inibizione di PMN Mac-1 ha portato ad una riduzione più potente (>3 volte) nell’adesione PMN rispetto all’inibizione di ICAM-1, suggerendo che Mac-1 lega altri ligandi superficie epiteliale oltre a ICAM-1.

Abbiamo poi esaminato se PMN apicalmente aderito dopo aver attraversato l’epitelio esposto locomozione apicale. La microscopia time-lapse a contrasto di fase è stata utilizzata per tracciare e quantificare il comportamento delle singole PMN attaccate alla membrana apicale del CEI. PMN in assenza di stimolo esogeno esposto poco movimento, tuttavia, 59.3 ± 7.6% di PMN apicalmente associati dopo la migrazione attraverso IECs esposto un comportamento altamente motile (Figura 2a) con distanze medie strisciando di 65.6 ± 6.2 um (Figura 2b). TEM indotto un robusto aumento dell’espressione Mac-1 sulla superficie cellulare PMN (Figura 2c), coerente con il suo ruolo in PMN-IEC interazioni apicali. Soprattutto, il numero di PMN esibendo locomozione apicale è stato significativamente aumentato quando IECs sono stati stimolati con IFNγ per upregolare ICAM-1 (88 ± 3,6%, IFNγ, vs 59,3 ± 7,6%, IEC non trattati). In queste condizioni, PMN viaggiato per distanze significativamente più lunghe (101 ± 10,0 um, IFNγ, vs 65,6 ± 6,2 um, IECs non trattati, Figura 2b) lungo la membrana epiteliale apicale. Confermando il ruolo di ICAM-1 nel mediare la locomozione PMN, l’aggiunta di una funzione di blocco anti-ICAM-1 anticorpo (Ab) ha invertito gli effetti IFNγ, riducendo sia il numero e le distanze percorse da PMN (61,4 ± 7,8% e 73,6 ± 6,1 um, rispettivamente, Figura 2a, b). Inibizione di Mac-1 abolito locomozione del PMN rimanente aderente (Figura 2a e filmati supplementari S1 e S2), confermando un ruolo esclusivo per Mac-1 in questo processo. Gli effetti di Mac-1 inibizione sulla locomozione PMN sono ulteriormente evidenziati in sequenze di immagini time-lapse (Figura 2d) e da traiettorie di spostamento di sei PMN rappresentativi (Figura 2e). PMN velocità di strisciamento variava da 3 a 7 μm min-1 e non erano significativamente diversi su unstimulated vs IFNγ-stimolato IECs (Figura supplementare S3B).

L’adesione delle PMN alla membrana epiteliale apicale compromette la funzione della barriera epiteliale

Allora abbiamo esaminato gli effetti delle interazioni delle PMN con ligandi epiteliali espressi apicalmente sulla funzione della barriera epiteliale. In questi esperimenti, PMN sono stati aggiunti apicalmente al confluente T84 IECs coltivato su supporti permeabili (0.4 micron dimensioni dei pori, troppo piccolo per consentire PMN TEM), e TER, come un indice di barriera epiteliale, è stato misurato oltre 12 ore in condizioni specificate. Il periodo di tempo di 12 ore è stato selezionato per evitare gli effetti di PMN apoptotiche sulla barriera epiteliale.29 fMLF (100 nM) -stimolato adesione PMN a T84 IECs innescato una diminuzione dipendente dal tempo in TER in un periodo di tempo di 12 ore (∼60%, Figura 3a). È importante notare che l’aggiunta di PMN alla membrana apicale di T84 IECs che sono stati pretrattati con IFNγ, che abbiamo dimostrato porta ad una maggiore adesione ICAM-1-dipendente PMN (Figura 1a), ha portato ad un’ulteriore diminuzione della TER (∼40% prima 2 h e ∼90% oltre 12 h). Il trattamento IFNγ da solo non ha avuto alcun effetto sul TER. Per verificare se l’aumento osservato della permeabilità epiteliale fosse dovuto a un contatto diretto tra le cellule epiteliali e il PMN, abbiamo usato un Ab inibitorio anti-Mac-1 (CBRM1/29, 20 μg ml-1) per inibire l’adesione del PMN alle IEC stimolate da IFNγ. L’inibizione di Mac-1 ha attenuato significativamente la diminuzione indotta dal PMN in TER dopo la stimolazione IFNγ (Figura 3a). Soprattutto, in esperimenti separati abbiamo ulteriormente confermato che la diminuzione indotta da PMN in TER in entrambi i monostrati epiteliali non stimolati e trattati con IFNγ dipendeva dal contatto diretto tra PMN e la membrana epiteliale apicale, e non mediato attraverso meccanismi paracrini. In tali esperimenti, i PMN sono stati aggiunti alla camera inferiore di transwells contenenti monostrati T84 invertiti (lato apicale rivolto verso il basso) e stimolati con fMLF (100 nM). In queste condizioni, non vi era alcun effetto di PMN sulla barriera epiteliale come valutato da TER (Figura 3b). L’esposizione di monostrati epiteliali a 100 nM fMLF per 12 ore non ha avuto alcun effetto significativo su TER.

Ligazione di ICAM-1 epiteliale innesca un aumento MLCK-dipendente nella permeabilità epiteliale intestinale

Abbiamo osservato che l’upregulation apicale di ICAM-1 potenziato significativamente gli effetti di Mac-1-dipendente adesione PMN sulla barriera epiteliale (Figura 3a). Abbiamo quindi ipotizzato che l’aumento PMN-indotta in permeabilità di IFNγ-trattati monostrati epiteliali era dovuto PMN contatto mediata ICAM-1 clustering e un’induzione di ICAM-1-dipendenti eventi di segnalazione, come precedentemente descritto in endotelio vascolare.30, 31 T84 IEC monostrati su supporti permeabili sono stati trattati con IFNγ per indurre l’espressione ICAM-1, seguita dalla aggiunta di reticolazione Abs a ICAM-1. Abbiamo confermato che Ab-mediata reticolazione indotto ICAM-1 clustering (Figura supplementare S2C). Come mostrato nella Figura 4a, Ab-mediata reticolazione di ICAM-1 provocato una diminuzione dipendente dal tempo in TER, che si correla con un aumento del flusso paracellulare di isotiocianato di fluoresceina (FITC)-destrano (3 kDa, Figura 4b). Questo effetto era specifico per ICAM-1, come reticolazione di altre molecole di superficie epiteliale, maggiore complesso di istocompatibilità-1 (MHC-1; Figura 4), e il ligando PMN noto, CD55 (Figura supplementare S5), non ha avuto alcun effetto significativo sulla permeabilità. Coerentemente con l’assenza di espressione di ICAM-1 su T84 IECs non stimolate, l’applicazione di reticolazione Abs alla superficie apicale di queste IECs in assenza di stimolazione IFNγ non ha avuto alcun effetto su TER (Figura supplementare S4A). Allo stesso modo, coerente con la localizzazione ICAM-1 indotta da IFNγ sulla membrana epiteliale apicale, l’applicazione di reticolazione Abs all’aspetto basolaterale dei monostrati epiteliali non ha avuto alcun effetto significativo sulla funzione di barriera (Figura supplementare S4B).

Abbiamo precedentemente dimostrato che gli eventi precoci nella TEM del PMN (a livello della membrana epiteliale basolaterale) innescano le diminuzioni mediate da MLCK in TER.9 MLCK ha dimostrato di avere un ruolo chiave nella regolazione della permeabilità epiteliale regolando la contrazione dell’anello periunzionale dell’actomiosina attraverso la fosforilazione della catena leggera regolatrice della miosina II.32 Abbiamo quindi chiesto se una maggiore permeabilità del CEI dopo la legatura di ICAM-1 espressa apicalmente fosse MLCK dipendente. Infatti, Ab-mediata reticolazione di ICAM-1 provocato fosforilazione MLCK (Tyr 464), coerente con l’attivazione MLCK (Figura 4c). Tale attivazione è stata accompagnata da una diminuzione del brush boarder apicale e della F-actina perijunctional (Figura 4d), indicativa della riorganizzazione citoscheletrica dell’actina. Soprattutto, l’inibizione della legatura ICAM-1 indotta fosforilazione MLCK in cellule T84 con ML-7 (20 μM,33 Figura supplementare S4C) ha impedito ICAM-1 indotta F-actina riorganizzazione (Figura 4d), la diminuzione della TER (Figura 4a), e l’aumento del flusso di destrano paracellulare (Figura 4b). Il trattamento ML-7 (20 μM) da solo non ha avuto alcun effetto su TER. Insieme, questi dati suggeriscono che in condizioni infiammatorie, il contatto PMN con la superficie apicale delle cellule epiteliali della cripta innesca eventi di segnalazione ICAM-1-dipendenti, con conseguente aumento della permeabilità.

L’impegno di ICAM-1 sulla membrana epiteliale apicale facilita una maggiore TEM delle PMN

Come la legatura di ICAM-1 espressa apicalmente ha aumentato la permeabilità epiteliale, abbiamo eseguito esperimenti per esaminare se le alterazioni dipendenti da ICAM-1 nella funzione di barriera epiteliale avrebbero portato ad una maggiore TEM delle PMN. Abbiamo prima indagato se l’impegno PMN di ICAM-1 sulla membrana apicale IEC influenzato PMN TEM nella direzione fisiologicamente rilevante basolaterale-apicale.34 In questi esperimenti, PMN sono stati stimolati a migrare attraverso monostrati epiteliali e le cellule trasmigrate sono stati raccolti e riapplicati per 1 h alla superficie apicale di nuovi monostrati epiteliali (2,5 × 105 PMN per monolayer) con o senza pretrattamento IFNγ. Dopo 1 h di contatto PMN-epiteliale, i monostrati sono stati lavati senza PMN aderenti e utilizzati per successivi saggi PMN TEM in direzione basolaterale-apicale. Introduzione apicale di PMN a IFNγ-trattato, ma non a monostrati epiteliali non trattati innescato un aumento significativo del PMN TEM (1.7 volte, Figura 5a). Il trattamento IFNγ da solo o la presenza di PMN vicino alla superficie apicale, ma senza contatto diretto con i monostrati, non ha avuto alcun effetto sul PMN TEM (Figura 5a). In esperimenti paralleli, PMN TEM è stato esaminato dopo specifico Ab-mediata reticolazione di ICAM-1. Coerentemente con l’effetto di ICAM-1 reticolazione sulla funzione di barriera IEC, Ab-mediata reticolazione di ICAM-1 su IFNγ trattati T84 IECs significativamente aumentato PMN TEM (1.9±fold, Figura 5b) rispetto alla reticolazione di una molecola di controllo espresso apicalmente, MHC-1. Come previsto, l’applicazione dei protocolli di reticolazione ICAM-1 a monostrati IEC non trattati non ha avuto alcun effetto significativo sul PMN TEM. Insieme, questi risultati suggeriscono che il PMN aderisce alla membrana apicale (luminale) IEC attraverso l’impegno di ICAM-1 può innescare alterazioni nella funzione di barriera epiteliale e contribuire alla regolazione del reclutamento PMN.

ICAM-1 crosslinking provocato l’attivazione MLCK, suggerendo contrazione actina-miosina (Figura 4). Così, abbiamo poi esaminato gli effetti di inibizione MLCK e l’inibizione della F-actina forze contrattili su PMN TEM dopo ICAM-1 crosslinking. Aumento PMN TEM indotta da ICAM-1 reticolazione è stato invertito quando IECs sono stati pretrattati con l’inibitore MLCK ML-7 (20 μM, 1 h33) o l’inibitore della miosina motore II, Blebbistatin (10 μM, 1 h,35 Figura 5c). Questi risultati suggeriscono un ruolo per la contrazione actomiosinica a valle di ICAM-1 nella regolazione PMN TEM. Il trattamento con ML-7 o Blebbistatina da solo non ha avuto alcun effetto su PMN TEM (Figura 5c).

Ab-mediata legatura di ICAM-1 nel lume intestinale murino porta a MLCK-dipendente aumento della permeabilità epiteliale e maggiore reclutamento PMN

Abbiamo poi eseguito in-vivo esperimenti per esaminare l’effetto di ICAM-1 legatura sulla funzione di barriera epiteliale intestinale e reclutamento PMN, utilizzando un modello di loop intestinale del mouse (Figura 6b). In questo modello, la permeabilità dei segmenti intatti, sangue-perfuso del piccolo intestino è stata valutata dopo l’introduzione di FITC-destrano al lume intestinale. Come mostrato nella Figura 6a, anche se ICAM-1 non è stato rilevato nell’epitelio non stimolato (pannello superiore), la somministrazione intraperitoneale (i.p.) di IFNγ e TNFα (500 ng, 24 h) ha portato ad una robusta induzione dell’espressione ICAM-1. In particolare, l’ICAM-1 indotta si è localizzata nelle regioni apicali delle cripte IECs murine sopra la Claudina-2 (Figura 6a, pannello inferiore). In parallelo, abbiamo osservato che il trattamento con le citochine ha provocato un aumento di ∼2 volte della permeabilità del FITC-destrano 3-kDa (Figura 6c).

Importante, l’introduzione di ICAM reticolazione Abs, ma non Abs alla proteina di controllo, MHC-1 nel lume di citochine-stimolati loop intestinali indotto un ulteriore ∼1.5 volte aumento della permeabilità al destrano rispetto al trattamento citochina da solo (Figura 6c). Per confermare che gli aumenti di permeabilità epiteliale intestinale sono stati mediati specificamente da epiteliale ICAM-1-indotti eventi di segnalazione, abbiamo usato peptidi derivati dal dominio citoplasmatico di ICAM-1 (ICAM-1 peptide) per inibire la capacità di ICAM-1 per mediare eventi di segnalazione a valle. E ‘stato precedentemente dimostrato in endotelio vascolare che ICAM-1, ma non peptide di controllo, inibito le interazioni tra ICAM-1 e proteine bersaglio, impedendo così ICAM-1-dipendente segnalazione senza influenzare il legame ai ligandi leucocitari extracellulari.22, 24 L’aggiunta di ICAM-1, ma non il peptide di controllo (100 μg ml-1, 30 min), inibito ICAM-1 legatura indotta aumenta la permeabilità intestinale (Figura 6c). Gli Abs introdotti intraluminalmente nelle anse intestinali (non stimolati e dopo l’attivazione IFNγ/TNFα) sono stati confermati per non attraversare l’epitelio, escludendo così il potenziale contributo indiretto delle cellule della lamina propria agli effetti osservati (Figura supplementare S6).

In ulteriore supporto del ruolo di MLCK nella segnalazione ICAM-1-mediata, inibizione dell’attivazione MLCK utilizzando ML-7 (1 mg kg-1, i.p.36) prima del crosslinking ICAM-1 ha impedito l’aumento della permeabilità (Figura 6c). Questi dati dimostrano che l’aumento della permeabilità epiteliale intestinale in vivo dopo la legatura ICAM-1 è MLCK dipendente.

Come la permeabilità epiteliale aumentata è associata a una maggiore migrazione PMN, abbiamo chiesto se la legatura di ICAM-1 avrebbe portato a un maggiore reclutamento PMN in vivo. Utilizzando il modello murino dell’ansa intestinale, l’infiltrazione delle PMN nella mucosa intestinale e la migrazione nel lume sono state indotte dalla somministrazione luminale del chemioattrattore CXCL1 (1 μM in 200 μl di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS)+) e quantificate dall’etichettatura di immunofluorescenza/microscopia confocale e dall’analisi del liquido lavato preparato sulle citochine e colorato con Diff-Quik, rispettivamente. In assenza di chemoattrattore, PMNs non sono stati rilevati nell’epitelio intestinale o nel lume intestinale (non mostrato), tuttavia, la somministrazione luminal di CXCL1 innescato migrazione PMN significativo nello strato epiteliale (Figura 7a) e accumulo nel lume intestinale (Figura 7c). Coerentemente con l’aumento della permeabilità indotto dalle citochine, il trattamento IFNγ/TNFα ha aumentato di 2,2 volte il numero di PMN nell’epitelio intestinale e di 1,7 volte nel lume. Soprattutto, l’aggiunta di ICAM-1 reticolazione Abs nel lume di citochine trattate loop intestinali ulteriormente aumentato (oltre trattamento citochina da solo) il numero di PMN sia nell’epitelio (∼1.6 volte, Figura 7a,b) e nel lume (∼1.4 volte, Figura 7c,d). PMN (verde) infiltrando l’epitelio intestinale (rosso) sono mostrati in immagini rappresentative di sezioni di tessuto da citochine attivato loop intestinali dopo ICAM-1 legatura (Figura 7b). Allo stesso modo, PMN che è migrato nel lume dopo ICAM-1 legatura sono mostrati in immagini rappresentative di fluidi di lavaggio da loop intestinali (Figura 7d).

Consistente con ICAM-1 legatura indotta aumenti di permeabilità epiteliale, maggiore migrazione PMN nel lume intestinale dipendeva da ICAM-1-mediata eventi di segnalazione e attivazione MLCK. Sia l’aggiunta intraluminale di ICAM-1 peptide, ma non il peptide di controllo (non mostrato; 100 μg ml-1, 30 min), e l’inibizione di MLCK (ML-7, 1 mg kg-1, i.p.) prima Ab-mediata reticolazione di ICAM-1 completamente inibito ICAM-1 legatura indotta aumenta la migrazione PMN (Figura 7a,c). Questi risultati suggeriscono che l’impegno di ICAM-1 sulla membrana epiteliale intestinale apicale in condizioni di infiammazione compromette la funzione di barriera, facilitando così un maggiore reclutamento di PMN in vivo.