La variazione genetica dei diversi stadi di sviluppo di Schistosoma japonicum: la distribuzione nelle lumache e la preferenza di accoppiamento favoriscono la trasmissione?
La raccolta dei campioni
La raccolta dei campioni e il disegno sperimentale sono riassunti nella Fig. 1. Le fasi di raccolta dei campioni sono descritte di seguito, compresa la raccolta delle lumache, la raccolta dei cercari, l’infezione dei topi e la raccolta dei vermi adulti, e la raccolta dei miracidi.
Flowchart della raccolta dei campioni e del disegno sperimentale
Raccolta delle lumache
Le lumache di Oncomelania hupensis sono state raccolte in marzo e settembre 2016 dalla zona orientale del lago Dongting (29° 32′ 5.25″ N, 112° 52′ 35.00″ E), provincia di Hunan, Cina. Le lumache sono state localizzate in fossati in 3 villaggi ad una distanza di 10 km. Il sito di raccolta è una palude e non un parco nazionale o altra area protetta o terreno privato. Le raccolte sono state effettuate con il permesso e l’assistenza dell’Istituto di Controllo della Schistosomiasi della Provincia di Hunan, Cina, che supervisiona il controllo delle lumache nella zona. L’Oncomelania hupensis non è una specie in pericolo o protetta. Le lumache sono state riportate in laboratorio e classificate come Gruppo A per quelle raccolte in marzo e Gruppo B per quelle raccolte in settembre. Dopo un mese di cattività, le lumache sono state lavate e trasferite in fiale individuali piene d’acqua per 3 ore sotto la luce a 25 °C, per stimolare l’emergere di cercarie per identificare l’infezione da S. japonicum. Infine, 20 lumache del gruppo A e 25 lumache del gruppo B sono state identificate come infette da S. japonicum.
Raccolta delle cercarie
Dopo che le cercarie sono state rilasciate dalle singole lumache, alcune sono state trasferite in un piatto usando un’ansa e lavate in una soluzione di lavaggio delle cercarie (5 g/l di idrolizzato di lattoalbumina, 6,8 g/l NaCl, 0,4 g/l KCL, 0,2 g/l CaCl2, 0,2 g/l MgSO4-7H2O, e 1 g/l glucosio) al microscopio. Dopo 3 lavaggi, le cercarie sono state pipettate singolarmente con 2 μl di soluzione di lavaggio sterilizzata su una carta Whatman™ FTA (GE Healthcare, Pittsburgh, USA). Dopo l’asciugatura, le carte sono state conservate in un sacchetto di plastica sigillato in un essiccatore a temperatura ambiente. Almeno 50 cercarie per lumaca sono state raccolte individualmente e conservate su schede Whatman™ FTA.
Infezione di topi con cercarie da singole lumache
Per distinguere le lumache infettate da S. japonicum monosesso, 2 topi Kunming da laboratorio sono stati infettati percutaneamente con 30 cercarie da ciascuna lumaca per topo. In totale, 40 topi sono stati infettati per 20 lumache del gruppo A, e 50 topi sono stati infettati per 25 lumache del gruppo B. I vermi sono stati recuperati dalle vene mesenteriche di ogni topo mediante perfusione con 0,9% NaCl e dissezione 7 settimane dopo l’infezione. Si è prestata attenzione a ridurre al minimo il potenziale di scissione dei vermi adulti accoppiati causato dalla forza meccanica durante la perfusione e la dissezione, utilizzando 3 tecnici esperti per elaborare i vermi il più rapidamente possibile. Ogni coppia di vermi è stata trasferita in provette separate per il lavaggio e marcata immediatamente, ed è stata conservata in etanolo assoluto a coppie una volta che si separavano spontaneamente. I vermi non accoppiati di ogni topo sono stati controllati al microscopio per confermare il sesso e poi conservati in etanolo.
Infezione dei topi con cercari messi in comune da tutte le lumache (Metodo I e II) e raccolta dei vermi adulti
Per le infezioni successive, 17 delle 20 lumache del Gruppo A e 16 delle 25 del Gruppo B sono rimaste vive e in grado di produrre cercari sufficienti. Per i due gruppi di lumache sono stati utilizzati due diversi metodi di raccolta delle cercarie. Per le 17 lumache rimanenti del gruppo A, tutte le lumache sono state messe insieme in un pallone contenente acqua per stimolare l’emergere delle cercarie (Metodo I). Trentuno topi sono stati poi infettati per via percutanea con 34 cercarie per ogni topo. Per l’infezione con 16 lumache del gruppo B, 2 cercarie da ogni lumaca che spargeva individualmente sono state messe insieme, e le 32 cercarie miste sono state usate per infettare un topo (Metodo II), replicando per infettare 22 topi in totale. Tutti i topi sono stati sacrificati per raccogliere S. japonicum vermi 7 settimane post-infezione come descritto sopra. Infine, sono stati raccolti 530 vermi dai topi con il Metodo I (Gruppo A), 484 vermi dai topi con il Metodo II (Gruppo B).
Raccolta dei miracidi
Prima che tutti i topi infetti fossero sacrificati per raccogliere i vermi adulti, sono state raccolte le feci di ogni topo per 7 giorni, per concentrare le uova escrete attraverso l’intestino per la schiusa dei miracidi. Il sedimento delle uova di ogni topo è stato esposto all’acqua declorurata in un pallone sotto la luce a 25 °C per far schiudere i miracidi. I miracidi sono stati raccolti dall’acqua superiore di ogni pallone con una pipetta e trasferiti in un piatto con una soluzione di lavaggio dei miracidi (5 g/l di idrolizzato di lattoalbumina, 6,5 g/l NaCl, 0,14 g/l KCl, 0,12 g/l CaCl2 e 0,20 g/l NaHCO3). Dopo 3 lavaggi, i miracidi sono stati pipettati singolarmente con 2 μl di soluzione di lavaggio sterilizzata su una carta Whatman™ FTA. Dopo essere stata asciugata, la carta è stata conservata in un sacchetto di plastica sigillato in un essiccatore a temperatura ambiente. Sono stati raccolti almeno 50 miracidia per feci di topo.
Sono stati raccolti anche i miracidia schiusi dalle uova intrappolate nel fegato di topi infetti come segue. Il fegato di ogni topo infetto è stato raccolto dopo la raccolta dei vermi adulti, omogeneizzato in 1,2% NaCl freddo e filtrato per ottenere il sedimento delle uova. I miracidi sono stati covati con lo stesso metodo usato per il campione di feci. Infine, almeno 50 miracidi per fegato di topo sono stati pipettati singolarmente e conservati su schede Whatman™ FTA.
Estrazione del DNA genomico
Per il DNA di un singolo campione di cercaria o miracidio, un disco di 2 mm di diametro è stato rimosso dal centro di ogni area di pipettaggio del campione di una scheda Whatman™ FTA utilizzando un micro punzone Harris da 2 mm (GE Healthcare Life Sciences, Stevenage, UK). Il disco è stato posto nella base di una piastra a 96 pozzetti da 1,2 ml con fondo a U. Dopo un lavaggio con 100 μl di reagente di purificazione FTA (GE Healthcare Life Sciences) per 5 minuti seguito da 100 μl di tampone TE (10 mM Tris-Cl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0), 14 µ di 0.1 M NaOH con 0.3 mM EDTA, pH 13.0 sono stati aggiunti ad ogni pozzetto e la soluzione è stata lasciata incubare per 5 minuti, dopodiché sono stati aggiunti 26 µl di tampone Tris-HCl 0.1 M, pH 7.0. Quindi la piastra è stata mescolata pulsando con un mixer vortex 3 volte per circa 10 s ciascuna. La soluzione è stata poi lasciata a temperatura ambiente per 10 min, pulsato 10 volte, e l’eluato è stato trasferito in una piastra pulita a 96 pozzetti, e conservato a – 20 °C per un ulteriore utilizzo.
Come per i singoli vermi adulti, la parte anteriore, compreso l’utero, è stata tagliata al microscopio da ogni verme femmina adulta per evitare l’influenza delle uova nell’utero sul genotipo del verme femmina. Mentre i vermi maschi interi o le femmine immature sono stati usati per l’estrazione del DNA. Il DNA genomico totale è stato estratto individualmente da ogni verme utilizzando una procedura standard di sodio dodecil solfato-proteinasi K come segue. Ogni verme è stato incubato e scongelato in 400 microlitri di tampone di estrazione contenente 50 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1% SDS, e 100 mg / ml di proteinasi K, a 56 ° C per 1 ora con miscelazione delicata. Il DNA in soluzione è stato estratto utilizzando la purificazione standard fenolo / cloroformio, seguita da acetato di sodio 3 M (pH 5,2) e la precipitazione di etanolo. Pellet di DNA sono stati lavati in etanolo al 70%, asciugato all’aria, e risospeso in 20 μl TE (pH 8.0), conservati a – 20 ° C come estratto di DNA grezzo del verme adulto per un ulteriore utilizzo.
Amplificazione PCR e genotipizzazione dei microsatelliti
Per confermare l’esistenza di DNA genomico nell’eluizione della scheda FTA o nell’estratto grezzo del campione conservato in etanolo, il frammento di DNA ribosomiale 28S è stato amplificato dalla soluzione di DNA di un singolo cercaria, miracidium o verme adulto, utilizzando i seguenti primer: forward (5′-GTG GAG TTG AAC TGC AAG C-3′) e reverse (5′-GCT CAA CAW TAA TAG TCA AAC CTG-3′). Le PCR sono state eseguite utilizzando le microsfere PCR Illustra PuReTaq Ready-To-Go in una piastra a 96 pozzetti (GE Healthcare Life Sciences, USA). Per ogni perlina sono stati aggiunti 2 µl di eluizione FTA da una singola larva o 0,5 µl di estratto grezzo da un singolo verme, con 1 µl di ciascun primer e acqua fino a un volume finale di 25 µl. L’amplificazione è stata eseguita con il seguente programma: 95 °C per 5 min; seguito da 40 cicli di 30 s a 95 °C, 30 s a 60 °C e 40 s a 72 °C; e una fase finale di estensione a 72 °C per 7 min. Le reazioni sono state poi controllate eseguendo 5 µl su un gel di agarosio TAE al 2%.
La genotipizzazione su piccola scala è stata fatta per 30 cercarie, 30 miracidi e 30 vermi scelti a caso, per costruire un pannello ottimale di loci microsatelliti multiplex per l’amplificazione PCR. Sono stati controllati 20 loci sviluppati e convalidati in studi precedenti e dal nostro laboratorio. Infine, 9 loci microsatelliti (file aggiuntivo 1: tabella S1) sono stati selezionati per formare il pannello. I loci microsatelliti per ogni campione di DNA sono stati genotipizzati usando il kit Type-it Microsatellite PCR (Qiagen, Manchester, UK) con il multiplex di 9 loci. Il primer forward di ogni coppia è stato etichettato con un colorante fluorescente appropriato, tra cui 6-FAM, HEX, TAMRA e ROX (file aggiuntivo 1: tabella S1). Le reazioni di PCR sono state preparate in una piastra PCR a 96 pozzetti utilizzando 6,25 µl di master mix 2×, 1,25 μl di soluzione Q, 0,5 μl di primer (10 μM), 2 μl di DNA template e 2,5 μl di ddH2O, poi eseguite in un termociclatore Bio-Rad con il seguente programma: 95 °C per 5 min; seguito da 35 cicli di 30 s a 95 °C, 90 s a 60 °C, e 3 minuti a 72 °C; seguito da una fase di estensione finale a 60 °C per 45 min. Le reazioni di PCR sono state controllate eseguendo 5 µl su un gel di agarosio TAE al 2% e le amplificazioni riuscite sono state inviate alla Sangon Biotech (Shanghai, Cina) per l’analisi dei frammenti su un analizzatore genetico ABI3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). I genotipi sono stati valutati utilizzando un plugin per microsatelliti di Geneious 11.0 . Tutti i campioni sono stati amplificati e genotipizzati due volte per ridurre la deviazione. In totale, i genotipi di 346 cercarie, 701 vermi adulti e 393 miracidi sono stati generati per le seguenti analisi.
Analisi della diversità genetica
La diversità genetica di ogni locus è stata stimata in tutte le cercarie genotipizzate calcolando il numero osservato di alleli (Na), il numero effettivo di alleli (Ae) in GenAlEx 6.5 e ricchezza allelica (Ar) e diversità genica (Hs) in hierfstat ver. 0.04-22 , includendo 156 cercari da 20 lumache del gruppo A e 190 cercari da 25 lumache del gruppo B. La deviazione dall’equilibrio di Hardy-Weinberg (HWE) per ogni locus è stata testata con il test Chi-quadrato in GenAlEx, e il test di linkage disequilibrium tra i loci è stato calcolato in SHEsis .
I Na, Ae, Ar e Hs sono stati calcolati per diverse popolazioni durante il processo di infezione dei topi come segue. Per le popolazioni cercariche utilizzate nell’infezione, sono stati valutati 132 cercari da 17 lumache del gruppo A (utilizzati nel metodo I) e 122 cercari da 16 lumache del gruppo B (utilizzati nel metodo II). Dopo la genotipizzazione e il filtraggio dei dati di bassa qualità, almeno 5 coppie di vermi adulti (quando presenti) e tutti i vermi non accoppiati di ogni topo sono stati genotipizzati con successo. In totale, sono stati coinvolti 357 vermi di topi nel Metodo I (usando cercari di 17 lumache del Gruppo A), 344 vermi di topi nel Metodo II (usando cercari ugualmente mescolati di 16 lumache individuali del Gruppo B). Inoltre, la diversità genetica dei vermi adulti in ogni topo è stata stimata per controllare la coerenza allelica dei vermi adulti tra i topi nel Metodo I e II separatamente. Per le popolazioni di miracidium, la diversità genetica dei miracidi dal fegato e dalle feci è stata calcolata a livello sovrapopolazione (miracidi dal fegato o dalle feci di tutti i topi), poiché solo 3-4 miracidi dal fegato o dalle feci in ogni topo sono stati genotipizzati, compresi 93 miracidi dal fegato (3 per topo) e 124 miracidi dalle feci (4 per topo) nel metodo I, e 88 miracidi da entrambi i fegati e dalle feci (4 per topo separatamente) nel metodo II.
Analisi della varianza molecolare (AMOVA)
La differenziazione genetica di tutti i cercari genotipizzati del gruppo A e del gruppo B è stata stimata utilizzando AMOVA in Arlequin ver. 3.5.2.2 . Dopo aver escluso le lumache non utilizzate per le infezioni dei topi, è stata testata la differenziazione tra 132 cercari di 17 lumache del gruppo A (per il metodo I) e 122 cercari di 16 lumache del gruppo B (per il metodo II). Dopo l’infezione, è stata testata la differenziazione tra 357 vermi adulti nel Metodo I e la popolazione originale di cercari (132 cercari del gruppo A). Inoltre, i 344 vermi del Metodo II sono stati testati contro i 122 cercari del gruppo B. Inoltre, la variazione dei vermi adulti tra 31 topi nel Metodo I e i vermi adulti tra 22 topi nel Metodo II sono stati valutati separatamente. Per i miracidi, la differenziazione genetica è stata testata tra 93 miracidi dal fegato e 124 miracidi dalle feci nel Metodo I, e lo stesso per 88 miracidi sia dal fegato che dalle feci nel Metodo II.
Analisi di parentela per i singleton di cercarie con niMLGs
Si è contato il numero di genotipi di cercari da ogni lumaca. Poiché è difficile distinguere gli errori di battitura o la mutazione somatica durante la moltiplicazione degli sporocisti dal genotipo originale del miracidio, un gruppo di genotipi di cercarie con meno di 2 alleli non corrispondenti sono stati identificati come niMLGs e assegnati a un lignaggio derivato dallo stesso miracidio in ogni lumaca. Infine, il numero di miracidi che hanno stabilito cloni genetici in ogni lumaca è stato valutato in base al numero di lignaggio utilizzando il pacchetto R allelematch ver. 2.5 .
Siccome i cercari con niMLGs in una lumaca si presumeva che derivassero da un miracidio, uno dei genotipi (singoletto) per niMLGs è stato assegnato a rappresentare un gruppo di cercari che hanno avuto origine da un miracidio con la funzione amCluster in allelematch, per produrre il set di dati filtrato per l’analisi di parentela tra miracidi. Poi, la parentela tra i singleton (miracidi) è stata stimata utilizzando il coefficiente di correlazione delle dimensioni degli alleli (I′) secondo Streiff in SPAGeDi ver. 1.5a a livello intra-lumaca e inter-lumaca per 20 lumache nel gruppo A e 25 lumache nel gruppo B, per scoprire se l’aggregazione di miracidi in una lumaca era correlata alla somiglianza genetica dei miracidi.
Distribuzione degli alleli per i sottoinsiemi di cercarie provenienti dal diverso numero di lumache
La distribuzione genetica non uniforme delle cercarie tra le lumache implica che la dimensione del campione di ospiti delle lumache influenzerebbe la distribuzione degli alleli della suprapopolazione di cercarie (cercarie di tutte le lumache). Na, l’indice di base per indicare l’abbondanza genica di una popolazione, è stato ulteriormente valutato per ogni locus in diversi sottoinsiemi di cercarie selezionando diversi numeri di lumache in modo casuale. Le lumache sono state selezionate in modo casuale ad ogni dato numero di lumache, che è stato impostato da 1 al massimo in ogni gruppo utilizzando la funzione base campione in R, con 100 repliche. In ogni replica, il numero di cercarie in ogni lumaca è stato fissato a 5, che è stato determinato secondo la fattibilità pratica e il numero medio di cercarie genotipizzate in ogni lumaca in questo studio. I genotipi delle cercarie per lo stesso numero di lumache sono stati uniti, e il Na è stato poi stimato per ogni locus con la funzione nb.alleles nel pacchetto R hierfstat. La relatività tra la diversità genetica e il numero di lumache è stata valutata calcolando la più piccola dimensione del campione di lumache quando il 50% e il 95% del totale Na era fissato.
Distanza genetica tra vermi adulti femmina e maschio
Per rilevare una potenziale preferenza genetica per S. japonicum durante l’accoppiamento, la distanza genetica inter-individuale Dsw tra il maschio e la femmina di ogni coppia nei singoli topi è stata misurata con Populations ver. 1.3.32 (http://www.bioinformatics.org/~tryphon/populations/), e confrontata con quella tra la femmina appaiata e i vermi non appaiati (se disponibili, non appaiati sono per lo più maschi) nello stesso ospite.
Identificazione della paternità per i miracidi
Le frequenze alleliche di tutti i vermi adulti e dei miracidi in ogni topo sono state analizzate e calcolate utilizzando la funzione Analisi della frequenza allelica in Cervus 3.0 . Tutti i 9 loci sono stati infine valutati come marcatori adatti per ulteriori analisi di parentela con una probabilità di non esclusione combinata inferiore allo 0,01%. La funzione Simulazione dell’analisi di parentela è stata applicata sulla base della frequenza allelica, per stimare il potere risolutivo dei loci codominanti e i valori critici della log-likelihood (LOD) con le seguenti ipotesi: 10.000 figli (miracidi) per ogni singolo topo; 10 madri e padri candidati in ogni topo (dimensione del campione stimata in base al numero di vermi adulti raccolti in un ospite); la proporzione di candidati è stata impostata al 100% dei vermi adulti genotipizzati; le altre opzioni sono state impostate per default. Infine, entrambi i risultati dell’analisi della frequenza degli alleli e della simulazione dell’analisi dei genitori sono stati riferiti nel modulo dell’analisi dei genitori, per assegnare ogni prole ai suoi genitori più probabili. I genitori che hanno più di 2 alleli non corrispondenti con la prole sono stati esclusi, e quelli che avevano il LOD più grande sono stati considerati i genitori più probabili.
Analisi statistica
Tutti i dati utilizzati nelle analisi statistiche in questo studio sono dati continui. La significatività della differenza sugli indici di diversità genetica (Na, Ae, Ar e Hs) dei loci, il coefficiente di parentela (I′) e la distanza genetica interindividuale (Dsw) tra due gruppi sono stati valutati con il livello di significatività di 0,05. In primo luogo, la distribuzione normale dei set di dati è stata controllata con il test di Sharpiro-Wilk. Il test t a coppie/indipendente è stato poi applicato quando i set di dati hanno soddisfatto la distribuzione normale. Altrimenti, il test Wilcoxon signed-rank e il test Mann-Whitney U sono stati applicati per i campioni correlati/indipendenti. La correzione di Bonferroni è stata utilizzata per correggere il valore P nei confronti multipli.