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DISCUSSIONE
Il sistema modello del sintetosoma del DNA contiene tutte le proteine necessarie per sostenere ogni fase del processo di replicazione del DNA, e queste proteine hanno dimensioni variabili da 20 a 240 kDa nelle attuali condizioni di test, e possono svolgere tutte le fasi del processo di replicazione del DNA in vitro. In questo studio, l’attività di primasi del DNA associata al sintetoma è stata caratterizzata esaminando la sintesi e l’estensione dei primer dell’RNA catalizzati in vitro dal sintetoma del DNA. I risultati delle nostre analisi funzionali mostrano che l’attività della DNA primasi associata al sintetoma nella frazione P4 derivata dalle cellule del cancro al seno è 30 volte superiore a quella degli estratti grezzi delle cellule del cancro al seno. La frazione P4, contenente il sintetoma del DNA, è stata derivata dalle frazioni proteiche solubili combinate nucleari e citoplasmatiche preparate dalle cellule MCF7 ed è stata utilizzata per eseguire il test di replicazione del DNA in vitro SV40. Le attività della DNA polimerasi α e δ e della DNA primasi nella frazione P4 sono 20-40 volte superiori a quelle degli estratti cellulari grezzi; il che la rende uno strumento utile per questi studi perché è pienamente competente a sostenere la sintesi e l’estensione dei primer di RNA in un sistema modello in vitro che ha dimostrato di sostenere tutte le fasi del processo di replicazione del DNA .
La DNA primasi mostra una processività unica nella sintesi e nell’estensione dei primer di RNA. Questa processività è definita da una competizione tra l’aggiunta del successivo nucleotide corretto e la dissociazione del complesso primer-template. La DNA primasi è l’unico enzima in grado di sintetizzare i primer dell’RNA durante l’inizio della sintesi del DNA. Nessuna delle singole subunità della primasi è in grado di sintetizzare o estendere un primer RNA da sola. Il sintetosoma contiene entrambe le subunità della primasi, (cioè p49 e p58) e può catalizzare la sintesi di primer di RNA in vitro usando un template poli(dT) esogeno. La sintesi sintetizza un primer di RNA funzionale di lunghezza unitaria (7-10 nt). Questi primer RNA sono completamente idrolizzati dalla RNasi in brevi frammenti di 1-4 bp, ma non sono idrolizzati dalla DNasi. La caratteristica distintiva della primasi associata al sintetoma, che la distingue da una primasi del DNA isolata, è la sua capacità specifica di estendere il primer RNA per formare un filamento DNA-primer. La sintesi di un filamento DNA-primer richiede anche l’attività della DNA polimerasi oltre a quella della DNA primasi. L’attività della DNA polimerasi è normalmente commutata per iniziare l’allungamento di un primer RNA dopo la sintesi del primer. Solo i primer di RNA lunghi ≥7 nucleotidi sono utilizzati dalla polimerasi, indipendentemente dalla concentrazione di dNTP. Quindi, la sintesi e l’estensione di primer RNA di lunghezza unitaria non richiede solo la primasi ma coinvolge anche la subunità α della DNA polimerasi p180 , e il sintetoma contiene DNA polimerasi altamente attive, che catalizzano l’incorporazione di deossiribonucleotidi per estendere il primer RNA. I primer dell’RNA sono estesi dalle polimerasi associate al sintetoma da un oligoprimer DNA-RNA di 20-40 nt di lunghezza (primer DNA). I filamenti di DNA-primer contengono due componenti: (1) un ribonucleotide di 10 nt e (2) un deossiribonucleotide di 20-40 nt. La RNasi e la DNasi idrolizzano separatamente i componenti appropriati dei filamenti DNA-primer con conseguente accorciamento ma idrolisi incompleta del filamento DNA-primer.
Un’altra caratteristica del sintetoma è la rapida sintesi e le dimensioni distinte del primer RNA e del filamento DNA-primer. Il sintetosoma catalizza la sintesi sia di un primer RNA che di un filamento DNA-primer rapidamente, e i livelli di stato stazionario sembrano accumularsi entro (5-15 min). Le dimensioni del primer RNA di lunghezza unitaria (7-10 nt) e del filamento DNA-primer (20-40 nt) catalizzati dal sintetosoma del DNA rimangono sempre costanti, indipendentemente dalla concentrazione del sintetosoma o dal tempo di reazione. Questo studio sul meccanismo dell’attività della DNA primasi implica che la sintesi dei primer dell’RNA, catalizzata dalla primasi associata al sintetoma, avviene attraverso una lenta iniziazione, una rapida polimerizzazione e una terminazione “intelligente” del primer. La DNA primasi si lega al modello di DNA e inizia lentamente la sintesi di un dinucleotide. Dopo la sintesi del dinucleotide, ulteriori NTP sono rapidamente aggiunti al dinucleotide polimerizzato dalla DNA primasi. L’attività della DNA primasi è caratterizzata dalla sintesi di ogni primer RNA in un singolo “scoppio” di attività, piuttosto che attraverso la sintesi distributiva. Una volta che i primer di lunghezza unitaria di 7-10 nt sono stati generati, la primasi-template agisce come un segnale di terminazione e inibisce l’ulteriore sintesi di RNA. Questa inibizione è dovuta alla generazione di un primer-template stabile, che probabilmente rimane associato al complesso pol α-primasi. È interessante notare che i filamenti di DNA-primer sintetizzati dal sintetoma del DNA in vitro sono simili ai primer di RNA sintetizzati in vitro. La sintesi di un DNA-primer strand raggiunge rapidamente i livelli di stato stazionario e la dimensione del DNA-primer strand rimane relativamente costante (tra 20 e 40 nt), indipendentemente dal tempo di reazione o dalla concentrazione del sintetosoma utilizzato durante la reazione di sintesi. La sintesi del filamento DNA-primer richiede l’attività della DNA polimerasi α oltre alla DNA primasi. I nostri risultati suggeriscono che l’attività della polimerasi α associata al sintetoma è anche caratterizzata da una rapida polimerizzazione e da una terminazione “intelligente” nella sintesi del filamento DNA-primer. Il sintesoma, con la caratteristica della rapida polimerizzazione e della terminazione intelligente del filamento DNA-primer, differisce dalla sintesi medicata dal frammento Klenow della DNA polimerasi I di E. coli durante l’estensione del primer RNA. In contrasto con il sintetoma, l’estensione del primer dell’RNA catalizzata dalla polimerasi I dipende fortemente dalla lunghezza del tempo di reazione. Aumentando il tempo di reazione aumenta significativamente la quantità e la dimensione dei primer RNA estesi.
Sono stati proposti due potenziali meccanismi per spiegare il passaggio dalla sintesi del primer all’estensione del primer durante il processo di replicazione del DNA. Il primo propone che il complesso primasi-polimerasi si dissocia dal primer-template e si riassocia con il sito attivo della polimerasi. Il secondo propone che l’interruttore si verifica in un intrastrand-translocazione del complesso pol α-primasi dal sito attivo della primasi al sito attivo della polimerasi α. Questo interruttore non comporta la dissociazione del complesso pol α-primasi dal template del DNA. I nostri esperimenti dimostrano che l’estensione del primer RNA catalizzata dalla polimerasi I è inibita da alte concentrazioni del sintetoma del DNA. La capacità del frammento Klenow di estendere un primer RNA dipende dalla sintesi di primer RNA catalizzata dal sintetoma, che ha anche bisogno di un sito di legame disponibile al terminale del primer RNA. Pertanto, il frammento Klenow della polimerasi I di E. coli richiede la dissociazione del complesso primasi-polimerasi dal primer-template. Tuttavia, alte concentrazioni del sintetoma competono con la polimerasi I per il sito di legame sul primer-template in modo che l’estensione del primer RNA sia inibita. Il sintetosoma forma un complesso senza uscita alla terminazione del primer dell’RNA; il risultato è l’incapacità del frammento Klenow di partecipare al processo di estensione del primer dell’RNA. Questo risultato suggerisce che il complesso polimerasi-primasi del sintetosoma del DNA deve dissociarsi dal primer-template dopo la sintesi del primer dell’RNA. Il nostro risultato mostra che il sintetoma aumenta la dimensione del primer RNA di lunghezza unitaria quando la temperatura di reazione viene ridotta. La diminuzione della temperatura di reazione aumenta l’efficienza della commutazione del complesso polimerasi-primasi e diminuisce la denaturazione del primer-template. Inoltre, la subunità p49 della DNA primasi contiene l’attività catalitica della RNA polimerasi, necessaria per aumentare la dimensione del primer RNA di lunghezza unitaria. Pertanto, i nostri risultati suggeriscono che il sintetoma del DNA ha l’appropriata attività di RNA polimerasi necessaria per formare frammenti di DNA RNA-primed.
L’analisi cinetica dell’inizio e dell’allungamento del primer dell’RNA dimostra che la DNA primasi associata al sintetoma è un enzima lento e relativamente debole rispetto al legame con il modello. La DNA primasi è anche una polimerasi dell’acido nucleico soggetta a errori perché questo enzima ha una capacità di discriminazione nucleotidica molto scarsa, con conseguente errata incorporazione dei nucleotidi. Pertanto, la nostra analisi della cinetica enzimatica dell’attività della DNA primasi associata al sintetoma potrebbe essere utilizzata per determinare la relazione tra i tassi di sintesi e le frequenze di errore durante la sintesi dei primer di RNA. La sintesi discontinua di frammenti di DNA (Okazaki) sul filamento in ritardo della forcella di replicazione è un importante processo biochimico durante la replicazione del DNA. Per assicurare un’efficace coordinazione tra la sintesi continua del DNA sul filamento principale e la sintesi discontinua del DNA sul filamento ritardatario, la DNA primasi richiede una serie precisamente temporizzata di passaggi enzimatici che controllano la sintesi del primer dell’RNA. Uno studio cinetico di un complesso di replicazione multiproteico del batteriofago T7 mostra che la primasi agisce come un freno molecolare e arresta transitoriamente la progressione della forcella di replicazione. A causa dell’interazione fisica della DNA polimerasi δ con la pol α, il risultato presentato da Lee et al. suggerisce che la DNA primasi può essere in grado di impedire che la sintesi del filamento principale superi la sintesi del filamento in ritardo durante i lenti passaggi enzimatici sul filamento in ritardo.
Vari modelli di replicazione del DNA eucariotico sono stati utilizzati nello studio della funzione della DNA primasi. Il sistema di replicazione della matrice nucleare del lisato di cellule intere è stato utilizzato per esaminare la sintesi e la distribuzione del primer RNA nativo e del DNA nascente RNA-primed nei nuclei di cellule eucariotiche utilizzando il template di DNA a doppio filamento legato alla matrice nucleare endogena. I primer a RNA sono strettamente associati alla matrice nucleare delle cellule di mammiferi in rapida proliferazione. I primer di RNA sono covalentemente attaccati al DNA appena replicato per formare il DNA nascente RNA-primed. Il DNA RNA-primed viene degradato in alcuni oligoribonucleotidi di ~10 nt di lunghezza dopo la digestione della DNasi, e almeno il 94% dei primer RNA nativi e del DNA nascente RNA-primed si trova all’interno della frazione di matrice insolubile del nucleo. I primer di RNA di 8-10 nt di lunghezza che si trovano associati alla matrice nucleare, costituiscono <1% dell’RNA totale nella cellula; rendendo molto difficile esaminare i primer di RNA e il DNA nascente RNA-primed nella frazione della matrice nucleare della cellula a causa di una concentrazione molto bassa di primer di RNA e la relativa grande quantità di altri RNA. Inoltre, l’isolamento dei primer di RNA e del DNA nascente RNA-primed dai lisati cellulari interi marcati con radio-nucleotidi è una procedura di purificazione complicata e non banale se applicata all’analisi della sintesi dei primer di RNA mediata dal modello di replicazione della matrice nucleare. Al contrario, il DNA sintetoma purificato dalle frazioni combinate nucleari e citoplasmatiche contiene una DNA primasi e una DNA polimerasi altamente attive, e supporta pienamente la sintesi di primer RNA nativi in vitro utilizzando un template di DNA a doppio filamento di origine SV40. I primer di RNA sintetizzati dal DNA sono di lunghezza normale (10-20 nucleotidi) e sembrano funzionare correttamente per sostenere l’estensione del primer da parte della DNA polimerasi. Questi primer RNA possono essere prontamente estesi per formare DNA nascente RNA-primed di 100-200 nt. La sintesi discontinua di frammenti di DNA (Okazaki) sul filamento in ritardo della forcella di replicazione è un importante processo biochimico coinvolto nella replicazione del DNA, e i frammenti di DNA (Okazaki) full-length RNA-primed sintetizzati dal sintetosoma del DNA sono anche circa 100-200 nucleotidi di lunghezza. Abbiamo osservato che il sintetosoma del DNA potrebbe sintetizzare diversi prodotti primed di RNA che vanno in dimensioni da 10 a 200 nt di lunghezza. Questo può essere considerato ragionevole, in quanto i primer dell’RNA nativo e il DNA nascente RNA-primed sono anche di questa lunghezza approssimativa. L’osservazione di cui sopra, che la sintesi dell’RNA primer e del DNA nascente RNA-primed, catalizzata dal DNA sintetoma, è essenzialmente equivalente a quella dello studio pubblicato utilizzando il modello di replicazione della matrice nucleare del lisato di cellule intere, suggerisce che il DNA sintetoma è un eccellente sistema modello in grado di effettuare un processo di replicazione del DNA fisiologicamente significativo in vitro.
Il modello del DNA sintetoma è quindi uno strumento unico e prezioso nello studio della funzione della DNA primasi. La sintesi mediata dalla primasi e l’estensione del primer dell’RNA e l’elongazione effettuate dal sintetoma del DNA assomigliano molto a quelle effettuate da altri modelli di replicazione senza cellule. Il modello del sintetoma supporta la sintesi e l’estensione dei primer dell’RNA in vitro usando modelli esogeni di DNA a singolo filamento e anche DNA a doppio filamento superavvolto contenente un’origine di replicazione SV40 intatta. Pertanto, il sintetosoma del DNA è pienamente in grado di mediare la sintesi e l’estensione di primer di RNA in vitro, e può facilitare l’ulteriore indagine dei meccanismi che iniziano la sintesi del DNA nelle cellule eucariotiche. Insieme i nostri risultati suggeriscono che il modello del sintetoma fornisce uno strumento unico per studiare l’interazione della DNA primasi e di altre proteine di replicazione durante il processo di replicazione del DNA.