C. diff Diagnostyka versus wykrywanie: Why Tests Remain Ambiguous
Clostridioides difficile jest najczęstszą przyczyną zakaźnej biegunki w placówkach służby zdrowia, a dane z systemu nadzoru Programu Pojawiających się Zakażeń CDC z 2011 r. szacują, że spowodował on prawie pół miliona zakażeń i 29 000 zgonów w ciągu 30 dni od postawienia diagnozy. Istnieje wiele testów dostępnych w celu zdiagnozowania zakażenia Clostridioides difficile (CDI) – wykrywających kwas nukleinowy, enzymy i/lub toksyny specyficzne dla C. difficile, w różnych kombinacjach i algorytmach – co doprowadziło do znacznego zamieszania dotyczącego interpretacji klinicznej i rozróżnienia między kolonizacją a prawdziwym zakażeniem.
Infectious Diseases Society of America (IDSA) opublikowało niedawno zaktualizowane wytyczne praktyki klinicznej dotyczące CDI, w tym zalecenia dotyczące testów. W zaleceniach tych stwierdza się, że preferowaną populacją do badania CDI są pacjenci z niewyjaśnioną i nową biegunką składającą się z ≥3 nieuformowanych stolców w ciągu 24 godzin. W przypadku instytucji, w których nie ma wcześniej ustalonych kryteriów instytucjonalnych dotyczących oddawania stolca przez pacjentów, najlepiej sprawdzającą się metodą, określaną na podstawie dodatnich i ujemnych wartości predykcyjnych, był test na obecność toksyn w stolcu jako część 2- lub 3-etapowego algorytmu, a nie sam test amplifikacji kwasu nukleinowego (NAAT). Przytaczają oni 2 powszechnie stosowane metody: 1) stosowanie testów na dehydrogenazę glutaminianową plus toksyny arbitrażowane przez test amplifikacji kwasu nukleinowego (NAAT) lub 2) NAAT plus test na toksyny. Zalecenie to zostało jednak ocenione jako „słabe” z „niską jakością dowodów”. Panel zwraca uwagę, że w rzeczywistości najbardziej czułą metodą diagnostyczną jest sam NAAT lub algorytm wieloetapowy, który powinien być stosowany, gdy istnieją wcześniej uzgodnione kryteria instytucjonalne dotyczące oddawania stolca.
Te zalecenia odzwierciedlają ciągły brak konsensusu dotyczącego optymalnych strategii rozpoznawania CDI. Zalecenia różnią się jeszcze bardziej, gdy weźmie się pod uwagę te pochodzące spoza Stanów Zjednoczonych: Wytyczne europejskie nadają priorytet wykrywaniu toksyn i kładą mniejszy nacisk na NAAT lub algorytmy wieloetapowe.
Strategie diagnostyczne i ograniczenia
Wykrywanie toksyn i hodowla: W przeszłości złotym standardem laboratoryjnym była hodowla toksynotwórcza, w której C. difficile była hodowana z kału, a izolaty badane pod kątem zdolności do wytwarzania toksyn; filtraty kału mogą być również bezpośrednio badane na obecność toksyn za pomocą testu cytotoksyczności komórkowej (CCNA) jako alternatywnej metody referencyjnej. Metody te wymagają kilku dni i dlatego nie nadają się do rutynowych badań laboratoryjnych. W dużym badaniu przeprowadzonym w Wielkiej Brytanii porównano hodowlę toksyn z testem cytotoksyczności na ponad 12 000 próbek i skorelowano wyniki z danymi klinicznymi. Stwierdzono, że dodatnie wyniki testów cytotoksyczności korelują ze zwiększoną śmiertelnością, natomiast dodatnie hodowle toksynotwórcze z ujemnymi wynikami testów toksyczności nie korelowały, co sugeruje, że wykrycie toksyny jest kluczowe dla klinicznej diagnostyki CDI. Wykrywanie toksyn za pomocą jakościowych testów immunoenzymatycznych (EIA) było kiedyś podstawą diagnostyki, jednak testy te mają znaczne ograniczenia czułości w porównaniu z hodowlą toksynotwórczą (52-75%), chociaż mają wyższą swoistość (96-98%) w porównaniu z hodowlą. Istnieje wiele dostępnych komercyjnych opcji laboratoryjnych do badania CDI, które zostały dobrze opisane w ostatnich przeglądach.
Detekcja dehydrogenazy glutaminianowej: Testy immunologiczne dehydrogenazy glutaminianowej (GDH) i inne testy molekularne rozwinęły się w celu rozwiązania problemu niskiej czułości wśród testów EIA na toksyny. Testy immunologiczne GDH wykrywają enzym metaboliczny o dużym stopniu konserwatywności, obecny we wszystkich izolatach C. difficile. Jednakże, antygen ten jest obecny zarówno w toksynotwórczych, jak i nietoksynotwórczych szczepach C. difficile, dlatego też test GDH może stanowić jedynie etap przesiewowy w dwu- lub trzystopniowym algorytmie, poprzedzający bardziej specyficzny test toksynowy i/lub test molekularny wykrywający gen toksyny.
NAAT: Chociaż NAAT był stosowany w badaniach od wczesnych lat 90-tych, pierwsza platforma zatwierdzona przez US Food and Drug Administration była dostępna dopiero w roku 2009. Obecnie dostępnych jest co najmniej 12 komercyjnych platform, które wykrywają cele genowe, w tym tcdA (gen toksyny A), tcdB (gen toksyny B) i 16S rybosomalny RNA (rRNA). Testy te są bardziej czułe niż EIA toksyny i ewentualnie EIA GDH, ale mniej czułe niż hodowla toksyn.
Badanie wieloetapowe oparte na algorytmie i ultraczułe wykrywanie toksyn: Złożoność świata badań CDI jest dodatkowo utrudniona przez sprzeczne dane dotyczące najlepszego algorytmicznego podejścia do diagnostyki. Naukowcy w jednoośrodkowym prospektywnym badaniu kohortowym porównali potrzebę leczenia i historię naturalną pacjentów, którzy byli toksyno-EIA-dodatni/PCR dodatni (131 pacjentów) z pacjentami toksyno-EIA-ujemnymi/PCR dodatnimi (162) i toksyno-EIA-ujemnymi/PCR ujemnymi (1123). Stwierdzili, że pacjenci toksynododatni/PCR-dodatni mieli więcej biegunek i powikłań związanych z CDI, podczas gdy grupy pacjentów toksynoujemnych/PCR-dodatnich i toksynoujemnych/PCR-ujemnych miały podobne wskaźniki powikłań żołądkowo-jelitowych w porównaniu do siebie (7,6% vs. 0% vs. 0,3%; p <0,001). Odnotowano 11 zgonów związanych z CDI w grupie toksynododatniej/PCR-dodatniej, jeden zgon w kohorcie toksynoujemnej/PCR-dodatniej oraz brak zgonów w grupie toksynoujemnej/PCR-ujemnej. Badacze doszli więc do wniosku, że samo badanie toksyn może być wystarczające do rozpoznania CDI, a stosowanie samych testów NAAT może prowadzić do nadrozpoznawalności i nadmiernego leczenia. Niemniej jednak, test NAAT i identyfikacja bezobjawowego nosicielstwa jest istotna dla celów kontroli zakażeń i epidemiologii.
Niestety, inna grupa badawcza doniosła, że brak toksyny w stolcu może nie być predyktorem ciężkości CDI i dlatego wyniki NAAT-dodatnie, EIA-ujemne nadal mają znaczenie kliniczne. Badacze zalecili, aby NAAT był stosowany jako podstawowa metoda diagnostyczna CDI, chociaż nie określili preferowanego algorytmu diagnostycznego. Do badania włączono 296 pacjentów, z których 143 zakwalifikowano jako prawdziwe CDI na podstawie wielu różnych metod. Nie stwierdzono różnicy w pozytywności toksyny EIA pomiędzy pacjentami z łagodną i ciężką chorobą (49% vs. 58%, p = 0,31). Wykrywanie toksyny EIA jest jednak ograniczone przez stosunkowo nieczułą granicę wykrywalności. Najlepiej działające analityczne granice wykrywalności dla EIA mieszczą się w zakresie 0,8-2,5 ng/ml, podczas gdy w przypadku testów cytotoksyczności opartych na komórkach stężenia toksyn obliczono w niektórych scenariuszach na zaledwie 30 pg/ml. Dlatego też w nowszych badaniach zastanawiano się, czy ultraczułe wykrywanie toksyn może w rzeczywistości lepiej odróżniać kolonizację od prawdziwego zakażenia, przy założeniu, że kolonizacja charakteryzuje się niższym poziomem toksyn.
Tę hipotezę sprawdzono w niedawnym, jednoośrodkowym, prospektywnym badaniu, w którym badano działanie ultraczułego testu do wykrywania i ilościowego oznaczania toksyn C. difficile, wykorzystującego technologię macierzy pojedynczych cząsteczek (Simoa), umożliwiającego analityczne odcięcie wynoszące około 1 pg/ml i kliniczne odcięcie wynoszące około 20 pg/ml. Naukowcy porównali stężenie toksyn u pacjentów z CDI NAAT dodatnich (n=122), zdefiniowanych jako ci, którzy mieli ≥3 nieuformowane stolce w ciągu 24 godzin przed pobraniem stolca lub uporczywą biegunkę w notatkach klinicznych, w porównaniu z bezobjawowymi nosicielami, którzy mieli NAAT dodatni (n=44), ale nie zgłaszali biegunki w ciągu 48 godzin przed pobraniem stolca. Naukowcy z zaskoczeniem stwierdzili, że stężenie toksyn A i B w stolcu nie jest w stanie odróżnić pacjenta z CDI od bezobjawowego nosiciela. Mediany stężenia toksyny A, toksyny B i toksyny A+B oraz wartości progu cyklu NAAT (Ct) w obu grupach były w rzeczywistości podobne. Częstość występowania stężeń toksyny A+B ≥ 20pg/ml (kliniczny punkt odcięcia) była porównywalna w grupach CDI-NAAT+ (65%) vs. carrier-NAAT+ (77%). Zauważono jednak, że jeśli grupy CDI i nosicieli zdefiniowano nie tylko na podstawie dodatniego wyniku NAAT, ale także na podstawie dodatniego wyniku toksyny (gdzie stężenie toksyny A + B ≥ 20 pg/ml), wówczas wystąpiły istotne różnice w medianie stężeń toksyny (mediana stężeń toksyny A, B i A+B) i wartości Ct. W związku z tym, podczas gdy w badaniu zaobserwowano, że pacjenci z bardzo niskim poziomem toksyny nadal mogą mieć znaczącą biegunkę zgodną z CDI i odwrotnie, pacjenci bezobjawowi mogą mieć znaczące ilości wykrytej toksyny, powyżej progu odcięcia dla toksyny pacjenci bezobjawowi mieli niższe stężenia wykrytej toksyny.
Podsumowując, ultraczułe wykrywanie toksyny nie wydaje się być świętym Graalem odpowiedzi na pytanie, jak skuteczniej diagnozować CDI i odróżniać chorobę od kolonizacji. Zaskakujące wyniki tego badania nasuwają centralne pytanie, dlaczego pacjenci z wysokim poziomem toksyny w stolcu mogą być bezobjawowi, a przeciwnie pacjenci z bardzo niskim poziomem toksyny mogą być objawowi. Niektórzy eksperci stawiają hipotezę, że czynniki gospodarza, takie jak przeciwciała przeciwtoksyny, mogą wyjaśniać, dlaczego pacjenci mogą być bezobjawowi pomimo obecności toksyn C. difficile w stolcu. Może się okazać, że test wykrywający takie przeciwciała lub inne biomarkery gospodarza, oprócz wykrywania patogenów, będzie konieczny do poprawy diagnostyki CDI. Podczas gdy z niecierpliwością oczekujemy dalszych badań nad diagnostyką CDI, pozostajemy w dobrze znanym obszarze medycyny klinicznej, gdzie testy dostarczają pomocniczych, ale nie ostatecznych dowodów na diagnozę i musimy być świadomi ich nieodłącznych ograniczeń.
Powyżej przedstawiono poglądy autora i nie muszą one odzwierciedlać opinii Amerykańskiego Towarzystwa Mikrobiologicznego.