Produkcja ludzkiej albuminy u świń poprzez CRISPR/Cas9-Mediated Knockin of Human cDNA into Swine Albumin Locus in the Zygotes
Human serum albumin (HSA) jest najobficiej występującym białkiem osocza, które pełni krytyczne funkcje homeostatyczne w fizjologii człowieka, w tym utrzymanie ciśnienia onkotycznego osocza, regulację dystrybucji płynów ustrojowych, transport małych cząsteczek itp.1. Jest przepisywana w wielu ciężkich chorobach, takich jak niewydolność wątroby i wstrząs pourazowy2. Ze względu na niedobór ludzkiej krwi i ryzyko z nią związane, od dawna poszukuje się alternatywnej produkcji ludzkiej albuminy. Rekombinowana produkcja HSA była wcześniej próbowana u świń poprzez dominującą ekspresję transgenu w postaci fuzji Albumin-GFP3. Jednakże, w podejściu transgenicznym, ze względu na obecność endogennej albuminy świńskiej, separacja i oczyszczanie rHSA są problematyczne. Wykorzystując możliwości systemu CRISPR/Cas9 w modyfikacji genomu, staraliśmy się wyprodukować rHSA u świń poprzez wbicie cDNA ludzkiej albuminy w locus albuminy świńskiej. Wprowadzając cDNA ludzkiej ALB plus sekwencję sygnałową SV40 polyA (2368 bp) do świńskiego locus Alb bezpośrednio poniżej kodonu startowego, spodziewamy się, że ludzka ALB będzie ulegać ekspresji pod kontrolą transkrypcyjną świńskiej endogennej albuminy i jednocześnie blokować ekspresję świńskiej endogennej albuminy (Rys. 1a). Zaprojektowaliśmy sgRNA ukierunkowany na region kodonu startowego (bezpośrednio 5′ od i włączając ATG) i wygenerowaliśmy fragment docelowy (donor dla rekombinacji homologicznej) z insertem otoczonym sekwencjami homologicznymi 1 kb po obu stronach (Ryc. 1a). Ponieważ 5′ sekwencji homologicznej użytej w donorze biegnie aż do kodonu startowego, zawiera ona sekwencję sgRNA, a zatem może być ukierunkowana przez sgRNA jako donor lub allel knockin po rekombinacji homologicznej. Aby temu zapobiec, wstawiliśmy 6 bp (gccacc) do sekwencji sgRNA tuż przed kodonem startowym. SgRNA zostało przepisane in vitro, oczyszczone i wstrzyknięte do zapłodnionych oocytów wraz z Cas9 mRNA4 i wektorem kolistym zawierającym fragment docelowy. Źródłem oocytów była Bama minipig5. Wstrzyknięte zarodki były hodowane przez 1-2 godziny przed implantacją do zsynchronizowanych z rują samic. ~300 zarodków wszczepiono 10 samicom, z których 5 zaszło w ciążę i urodziło w sumie 16 żywych szczeniąt. Szczenięta były pod standardową opieką i nie wykazywały żadnych oznak nietypowych problemów zdrowotnych.
Knockin ludzkiego ALB do świńskiego Alb locus.
(a) Schemat strategii knockin. (b) Genotypowanie założycieli. Startery PRC są pokazane w (a). (c) Wyniki sekwencjonowania produktów PCR uzyskanych za pomocą pary primerów e/f (a). Produkty zostały sklonowane i sekwencjonowano do 12 klonów (dla #9).
Obcięliśmy końcówki uszu 16 prosiąt, gdy miały około 4 tygodnie i uzyskaliśmy genomowe DNA do genotypowania. Aby określić czy udało nam się znokautować, ocenialiśmy zarówno 5′ jak i 3′ koniec miejsca insercji. Użyliśmy dwóch par primerów, a/b i c/d (Rys. 1a). Primer a znajduje się poza 5′-końcem użytej homologii, a b jest na ludzkim ALB (insercja); c jest na ludzkim ALB, a d poza 3′-końcem homologii. Jak pokazano na Rys. 1b, wszystkie 16 prosiąt jest nosicielami zamierzonego allelu knockin. Sklonowaliśmy i zsekwencjonowaliśmy wszystkie amplifikowane fragmenty DNA. Były to oczekiwane produkty rekombinacji homologicznej (Rys. S1). Następnie określiliśmy status allelu typu dzikiego u tych prosiąt. Primery e i f (zawarte wewnątrz insertu) (Rys. 1a) powinny amplifikować fragment 705 bp z locus wildtype i fragment 3085 bp z allelu knockin. Zgodnie z oczekiwaniami, wszystkie z nich wygenerowały fragment 3085 bp. Jednakże, nieoczekiwanie, mogliśmy uzyskać pozorny 705 bp fragment wildtype tylko z 7 (# 5, 6, 9, 10, 12, 13 i 15) z 16 próbek, z resztą generującą słabe produkty około 700 bp (Rys. 1b). Widoczny brak allelu wildtype u niektórych prosiąt sugeruje, że knockin mógł wystąpić na obu allelach. Alternatywnie, allel wildtype mógł być edytowany w taki sposób, że sekwencja primera a została usunięta, co spowodowało brak amplifikacji allelu wildtype. Rzeczywiście, edycja na allelu wildtype miała miejsce, ponieważ rozmiar amplifikowanych fragmentów różnił się od przewidywanego 705 bp u niektórych prosiąt (Fig. 1b). Aby to potwierdzić, sklonowaliśmy i zsekwencjonowaliśmy wszystkie amplifikowane fragmenty. Jak pokazano na Rys. 1c, wszystkie były zedytowane, chociaż niektóre z nich miały tylko kilka zmian par zasad (stąd wydawały się być na poziomie 705 bp). Wśród tych zedytowanych alleli, te znalezione u prosiąt #10 i #12 są interesujące. Ten w #10 był produktem zastąpienia odcinka 29 bp (od ATG w kierunku 3′ końca) sekwencji świni przez 36 bp (6 bp 5′ od ATG i 26 bp po nim) sekwencji dawcy. Nie jest jasne, jak to się stało. W #12, są dwa różne edytowane allele, co daje całkowitą liczbę alleli na 3, wskazując na mozaikowatość u tego prosięcia, co nie jest rzadkie, ponieważ mozaikowatość była często znajdowana u zwierząt generowanych przez wstrzyknięcie Cas9/sgRNA6,7,8,9,10 do zygoty.
Aby określić czy doszło do off-targetingu z sgRNA, wybraliśmy 4 najlepsze potencjalne miejsca off-targetingu w oparciu o sugestie z narzędzia do projektowania CRISPR (http://tools.genome-engineering.org) i amplifikowaliśmy fragmenty zawierające te miejsca z genomowego DNA końcówki ucha prosięcia #14. Fragmenty te zostały poddane testowi T4EN I4. Jak pokazano na Rys. S2, nie stwierdzono żadnej edycji off-target. Jednakże, nie mogliśmy wyeliminować możliwości, że edycja off-target miała miejsce w innych loci lub u pozostałych 15 transgenicznych świń. Niemniej jednak, nawet jeśli doszło do edycji poza celem, edytowane loci prawdopodobnie nie będą problematyczne dla naszego celu produkcji rHSA, tak długo jak nie będą kolidować z dobrostanem tych transgenicznych świń.
Po wykazaniu udanego knockin ludzkiego ALB, staraliśmy się określić czy ludzka albumina może być wykryta w osoczu krwi tych znokautowanych prosiąt. Jak pokazano na Rys. 2a, wszystkie prosięta zawierały ludzką albuminę w ich osoczu krwi wykrywalną za pomocą przeciwciał specyficznych przeciwko ludzkiej albuminie, aczkolwiek na różnych poziomach, co jest prawdopodobnie wynikiem co najmniej dwóch czynników, czy oba allele są znokautowane i stopnia mozaicyzmu (szczególnie w wątrobie). Poziom w #7 jest bardzo niski, widoczny dopiero po długim naświetlaniu blotu, pomimo pozornego braku allelu dzikiego Alb u świni (Ryc. 1a). Ogólnie rzecz biorąc, poziomy te są znacznie niższe niż w surowicach dorosłych ludzi. Wiadomo, że stężenie albuminy we krwi u świń wzrasta wraz z wiekiem, osiągając poziom podobny do tego u dorosłych ludzi do 6 miesiąca życia11.
Analiza ludzkiej ALB we krwi.
(a) Wykrywanie metodą Western blot ludzkiej albuminy we krwi prosiąt założycieli. 0,5 μl osocza od każdego założyciela rozdzielono na SDS-PAGE i poddano analizie. Osocze krwi ludzkiej (0,5 μl po 30-krotnym rozcieńczeniu) zostało użyte jako kontrola pozytywna. C, osocze od świni wildtype. (b) Ilustracja peptydów tryptycznych (zielony) wykrytych za pomocą analizy mass spec. (c) Półkwantyfikacja dwóch peptydów tryptycznych z albuminy ludzkiej i świńskiej poprzez pomiar powierzchni pików każdego peptydu. Na czerwono zaznaczono reszty aminokwasowe, które są specyficzne dla świni.
Aby potwierdzić, że rHSA wykryta w osoczu naszych prosiąt knockin z przeciwciałami jest prawdziwie ludzką albuminą, poddaliśmy dwie próbki osocza (prosię #2 i #6) analizie spektralnej mas. #2 jest najwyraźniej homozygotyczny dla allelu knockin, a #6 zawiera jeden allel knockin i jeden zmutowany (frameshift) (Rys. 1). 0,5 μl osocza rozdzielano na SDS-PAGE, a białka o masie około 70 KD trawiono trypsyną w żelu. Peptydy tryptyczne były eluowane z żelu, suszone i ponownie rozpuszczane w celu rozdzielenia za pomocą chromatografii cieczowej i analizy mass spec. W przypadku świnki #2 udało się wykryć 14 unikalnych ludzkich peptydów tryptycznych ALB, a w przypadku #6 – 15 (Rys. 2b). Widma M/Z dla ludzkiego peptydu FKDLGEENFK i świńskiego peptydu FKDLGEQYFK (oba z prosięcia #2) pokazano na Rys. S3. Dwa peptydy zostały wybrane do kwantyfikacji poprzez pomiar powierzchni pików. Zgodnie z wynikami Western Blot, te dwa peptydy były znacznie bardziej obfite (~5 razy) w #2 niż w #6 (Rys. 2c). Wyniki te dowodzą, że rHSA wykryte przez przeciwciała jest autentyczną ludzką albuminą.
Genotypowanie DNA wyizolowanego z końcówek uszu wskazuje, że zarówno #2 jak i #6 nie zawierają alleli dzikiej świni Alb, ani nie są obecne, ani zredagowane (Fig. 1b,c). Jednakże, nadal mogliśmy wykryć peptydy tryptyczne z albuminy świń w obu próbkach, ale w znacznie niższej obfitości (Rys. 2c). Co ciekawe, obfitość peptydów świńskich była mniej więcej taka sama w obu próbkach, mimo że obfitość peptydów ludzkich znacznie się różniła. Wyniki te sugerują, że oba prosięta zawierają podobną liczbę hepatocytów wildtype (lub heterozygotycznych), które są odpowiedzialne za świńską ALB wykrytą we krwi tych dwóch prosiąt. Jednakże, takie komórki zawierające allel wildtype mogą nie istnieć lub istnieć w bardzo niskim odsetku w końcówkach uszu, tak że allel wildtype nie mógłby być amplifikowany PCR. Ponadto, analiza Southern blot z sondą wewnętrzną (3′ połowa CDS ludzkiego ALB) wskazała na obecność dodatkowej insercji sekwencji dawcy u prosiąt #1, 4 i 5 (Fig. S4). Wszystkie te komplikacje nie będą problemem dla celów produkcji rekombinowanej ludzkiej albuminy, ponieważ allel knockin może być oczyszczony przez krzyżowanie wsteczne.
Aby określić, czy allel knockin może być przekazywany do następnego pokolenia, skrzyżowaliśmy #2 (samiec, homozygotyczny) z #5 (samica, heterozygotyczna), gdy stali się dojrzali reprodukcyjnie. Z tej krzyżówki urodziło się 6 szczeniąt. 4 z nich (#1, 3, 4 i 6) są homozygotyczne dla allelu knockin (AlbH/H, H oznacza człowieka), a 2 (#2 i 5) heterozygotyczne (AlbP/H, P oznacza świnię) (ryc. 3a). #5 i 6 zmarły z powodu biegunki około 2 tygodnie po urodzeniu. Przeanalizowaliśmy ekspresję albuminy ludzkiej we krwi pozostałych prosiąt w 4 tygodniu życia. Jak pokazano na Rys. 3b, wszystkie z nich mają ludzką albuminę we krwi. Co ciekawe, poziom albuminy ludzkiej u zwierzęcia heterozygotycznego (#2) był znacznie niższy niż u homozygot. Nie wiemy, czy jest to wynik indywidualnej zmienności, czy też allel knockin jest w jakiś sposób tłumiony przez allel wildtype.
Przekazywanie allelu knockin przez linię.
(a) Genotypowanie PCR potomstwa F1. Użyto tych samych starterów co na Rys. 1. (b) Wykrywanie metodą Western blot albuminy ludzkiej we krwi prosiąt F1. 0,5 μl osocza od każdego prosięcia rozdzielono na SDS-PAGE i poddano analizie. C, osocze od świni wildtype. M, marker masy cząsteczkowej.
Pokazujemy tutaj udane pokolenie świń niosących ludzkie cDNA ALB znokautowane w locus świńskiego Alb. Jest to jeden krok dalej niż prosta edycja genu w zygotach świń zgłoszona ostatnio przez Hai et al.12 i nas13. Duże zwierzęta udomowione są wykorzystywane jako bioreaktory dla białkowych produktów biomedycznych14,15,16,17,18,19,20. Zazwyczaj sekwencje kodujące tych białek były wprowadzane losowo wraz z niezbędnymi elementami kontroli transkrypcji do genomu jako transgen, co wiąże się z wieloma komplikacjami, w tym krótkoterminowym charakterem ekspresji transgenów. Nasza demonstracja, że rekombinacja homologiczna może zachodzić bardzo wydajnie w zygotach świń otwiera drzwi do rozwoju coraz lepszych bioreaktorów, jak również szczepów zwierząt hodowlanych o coraz bardziej pożądanych cechach.