Transmigrated neutrophils in the intestinal lumen engage ICAM-1 do regulacji bariery nabłonkowej i rekrutacji neutrofilów

Transmigrated neutrophils in the intestinal lumen engage ICAM-1 do regulacji bariery nabłonkowej i rekrutacji neutrofilów

ICAM-1 promuje adhezję PMN i lokomocję na apikalnej błonie nabłonkowej w warunkach zapalenia

W ropniach krypt, jak obserwuje się w aktywnym IBD, PMN naciekające krypty jelitowe są często obserwowane w intymnym kontakcie z apikalną (luminalną) powierzchnią nabłonka.14 Aby zbadać interakcje PMN-IEC podczas późnych etapów TEM, modelowaliśmy migrację PMN przez nabłonek jelitowy w warunkach zapalnych przy użyciu wcześniej opisanego zestawu transwaginalnego.19 TEM PMN w fizjologicznym kierunku od podstawy do wierzchołka przez kontrolne lub poddane działaniu interferonu-γ (IFNγ) T84 IECs indukowano przez dodanie transepitelialnego gradientu N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLF) (100 nM). Ekspozycja T84 IECs na IFNγ (100 U ml-1, 24 h) nie miała znaczącego wpływu na funkcję barierową IEC lub ekspresję i subkomórkową lokalizację kluczowych białek połączeń JAM-A, okludyny i ZO-1 (Supplementary Figure S1 online). Leczenie IFNγ nie miało znaczącego wpływu na liczbę PMN, które ukończyły TEM, jednak znacząco zwiększyło liczbę PMN związanych koniuszkowo (z 8,7±1,8%, nieleczonych, do 19,7±1,9%, IFNγ, koniuszkowo, Figura 1a). Zgodnie z tym wzrostem, liczba niemigrujących PMN (PMN w górnej komorze, podstawowa) była znacznie zmniejszona (∼ 1,5-krotnie) po leczeniu IFNγ, sugerując zwiększoną szybkość migracji (Figura 1a). Liczba PMN w obrębie monowarstwy nabłonka (epith) nie uległa zmianie. Reprezentatywne konfokalne obrazy immunofluorescencji (Figura 1b, górne panele) i projekcje z (dolne panele) pokazują apikalnie związane PMN po migracji przez monowarstwy T84 stymulowane IFNγ, ale nie kontrolne. Ponieważ wcześniej wykazano, że IFNγ indukuje ekspresję ICAM-1 w zapalnie zmienionym nabłonku,27 wysunęliśmy hipotezę, że podczas zapalenia, PMN migrujące przez monowarstwy nabłonka pozostają przylegające do błony wierzchołkowej poprzez interakcje zależne od Mac-1- i ICAM-1, a zatem będą zdolne do lokomocji zależnej od ICAM-1, jak to wcześniej zaobserwowano w śródbłonku naczyniowym.24, 28 Potwierdzając poprzednie ustalenia, leczenie IFNγ (100 U ml-1, 24 h) wywołało silny, zależny od czasu wzrost ekspresji ICAM-1 (szczyt 24 h po leczeniu, Figura 1c,d) na błonie koniuszkowej T84 IECs (Figura 1e). Efekt ten był specyficzny dla IFNγ, ponieważ ekspozycja T84 i SKCO15 IECs na czynnik martwicy nowotworów-α (TNFα; 10 ng ml-1) nie indukowała ekspresji ICAM-1 (Supplementary Figure S2A,B). Podwyższenie ICAM-1 obserwowano również w nabłonku krypt biopsji okrężnicy od pacjentów z aktywnym wrzodziejącym zapaleniem jelita grubego w porównaniu ze zdrową błoną śluzową (Figura 1f). Ponadto, potwierdzając ICAM-1- i Mac-1-zależną adhezję PMN do apikalnych błon IEC, dodanie przeciwciał blokujących funkcję ICAM-1 lub Mac-1 (Abs; 20 μg ml-1) odwróciło indukowany przez IFNγ wzrost adhezji PMN (Supplementary Figure S3A). Co ciekawe, hamowanie Mac-1 PMN powodowało silniejsze zmniejszenie (> 3-krotne) adhezji PMN w porównaniu z hamowaniem ICAM-1, co sugeruje, że Mac-1 wiąże inne ligandy powierzchni nabłonka oprócz ICAM-1.

Następnie zbadaliśmy, czy apikalnie przylegające PMN po przejściu przez nabłonek wykazywały lokomocję apikalną. Mikroskopia poklatkowa z kontrastem fazowym została użyta do śledzenia i oceny ilościowej zachowania pojedynczych PMN przyczepionych do błony apikalnej IEC. PMN przy braku bodźców egzogennych wykazywały niewielki ruch; jednakże 59,3±7,6% PMN przyczepionych do błony koniuszkowej po migracji przez IEC wykazywało dużą ruchliwość (Rysunek 2a) ze średnią odległością pełzania 65,6±6,2 μm (Rysunek 2b). TEM indukował silny wzrost ekspresji Mac-1 na powierzchni komórek PMN (Rysunek 2c), co jest zgodne z jego rolą w interakcjach wierzchołkowych PMN-IEC. Co ważne, liczba PMN wykazujących lokomocję koniuszkową była znacząco zwiększona, gdy IEC były stymulowane IFNγ w celu zwiększenia regulacji ICAM-1 (88±3,6%, IFNγ, vs. 59,3±7,6%, nieleczone IEC). W tych warunkach PMN przemieszczały się na znacząco większe odległości (101±10,0 μm, IFNγ, vs. 65,6±6,2 μm, nieleczone IECs, Rycina 2b) wzdłuż apikalnej błony nabłonkowej. Potwierdzając rolę ICAM-1 w mediowaniu lokomocji PMN, dodanie blokującego funkcję przeciwciała anty-ICAM-1 (Ab) odwróciło efekt IFNγ, redukując zarówno liczbę jak i odległość pokonywaną przez PMN (odpowiednio 61.4±7.8% i 73.6±6.1 μm, Figura 2a,b). Inhibicja Mac-1 znosiła lokomocję pozostałych przylegających PMN (Rysunek 2a i filmy uzupełniające S1 i S2), potwierdzając wyłączną rolę Mac-1 w tym procesie. Wpływ inhibicji Mac-1 na lokomocję PMN jest dodatkowo uwidoczniony w sekwencjach obrazów poklatkowych (Figura 2d) oraz na trajektoriach przemieszczania się sześciu reprezentatywnych PMN (Figura 2e). Prędkości pełzania PMN wahały się od 3 do 7 μm min-1 i nie różniły się znacząco na niestymulowanych vs. stymulowanych IFNγ IECs (Supplementary Figure S3B).

Przyleganie PMN do apikalnej błony nabłonkowej upośledza funkcję bariery nabłonkowej

Następnie zbadaliśmy wpływ interakcji PMN z apikalnie wyrażonymi ligandami nabłonkowymi na funkcję bariery nabłonkowej. W tych eksperymentach, PMN były dodawane apikalnie do konfluentnych T84 IECs hodowanych na przepuszczalnych podporach (o wielkości porów 0,4 μm, zbyt małych, aby umożliwić PMN TEM), a TER, jako wskaźnik bariery nabłonkowej, był mierzony przez 12 godzin w określonych warunkach. Okres 12-h został wybrany w celu uniknięcia wpływu apoptotycznych PMN na barierę nabłonkową.29 fMLF (100 nM) – stymulowana adhezja PMN do T84 IECs wywołała zależny od czasu spadek TER w okresie 12-h (∼60%, Figura 3a). Co ważne, dodanie PMN do apikalnej błony T84 IEC, które były wstępnie traktowane IFNγ, co jak wykazaliśmy prowadzi do zwiększonej adhezji PMN zależnej od ICAM-1 (Figura 1a), spowodowało dalszy spadek TER (∼40% w ciągu pierwszych 2 h i ∼90% w ciągu 12 h). Samo leczenie IFNγ nie miało wpływu na TER. Aby sprawdzić, czy obserwowany wzrost przepuszczalności nabłonka był spowodowany bezpośrednim kontaktem między komórkami nabłonka i PMN, użyliśmy anty-Mac-1 inhibitory Ab (CBRM1/29, 20 μg ml-1), aby zahamować adhezję PMN do stymulowanych IFNγ IECs. Inhibicja Mac-1 znacząco osłabiła indukowany przez PMN spadek TER po stymulacji IFNγ (Figura 3a). Co ważne, w oddzielnych eksperymentach potwierdziliśmy, że indukowany przez PMN spadek TER zarówno w monowarstwach nabłonkowych niestymulowanych, jak i poddanych działaniu IFNγ był zależny od bezpośredniego kontaktu PMN z błoną apikalną nabłonka, a nie pośredniczył w mechanizmach parakrynnych. W takich eksperymentach PMN były dodawane do dolnej komory transwerów zawierających odwrócone (apikalną stroną do dołu) monowarstwy T84 i stymulowane fMLF (100 nM). W tych warunkach nie zaobserwowano wpływu PMN na barierę nabłonkową ocenianą przez TER (Figura 3b). Ekspozycja monowarstw nabłonka na 100 nM fMLF przez 12 h nie miała znaczącego wpływu na TER.

Ligacja nabłonkowej ICAM-1 wyzwala zależny od MLCK wzrost przepuszczalności nabłonka jelitowego

Zaobserwowaliśmy, że apikalna upregulacja ICAM-1 znacząco potęgowała efekty zależnej od Mac-1 adhezji PMN na barierę nabłonkową (Figura 3a). Postawiliśmy więc hipotezę, że indukowany przez PMN wzrost przepuszczalności monowarstw nabłonkowych traktowanych IFNγ był spowodowany kontaktem PMN z ICAM-1 i indukcją zależnych od ICAM-1 zdarzeń sygnalizacyjnych, jak wcześniej opisano w śródbłonku naczyniowym.30, 31 Monowarstwy T84 IEC na przepuszczalnych podporach traktowano IFNγ w celu wywołania ekspresji ICAM-1, a następnie dodano krzyżowe wiązanie Abs do ICAM-1. Potwierdziliśmy, że Ab-mediated crosslinking indukował grupowanie ICAM-1 (Supplementary Figure S2C). Jak pokazano na Figurze 4a, sieciowanie ICAM-1 za pomocą Ab spowodowało zależne od czasu zmniejszenie TER, które korelowało ze zwiększonym parakomórkowym przepływem izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC) -dextranu (3 kDa, Figura 4b). Efekt ten był specyficzny dla ICAM-1, ponieważ sieciowanie innych cząsteczek powierzchni nabłonka, głównego kompleksu zgodności tkankowej-1 (MHC-1; Figura 4) i znanego liganda PMN, CD55 (Dodatkowa Figura S5), nie miało znaczącego wpływu na przepuszczalność. Zgodnie z brakiem ekspresji ICAM-1 na niestymulowanych T84 IECs, zastosowanie Abs do sieciowania na apikalnej powierzchni tych IECs przy braku stymulacji IFNγ nie miało wpływu na TER (Supplementary Figure S4A). Podobnie, zgodnie z indukowaną przez IFNγ lokalizacją ICAM-1 na apikalnej błonie nabłonkowej, zastosowanie Abs sieciujących do podstawno-bocznego aspektu monowarstw nabłonkowych nie miało znaczącego wpływu na funkcję bariery (Supplementary Figure S4B).

Wcześniej wykazaliśmy, że wczesne zdarzenia w TEM PMN (na poziomie podstawno-bocznej błony nabłonkowej) wyzwalają MLCK-mediowane przez MLCK spadki TER.9. Wykazano, że MLCK odgrywa kluczową rolę w regulacji przepuszczalności nabłonka poprzez regulację skurczu pierścienia aktyomiozyny okołozębowej poprzez fosforylację regulacyjnego łańcucha lekkiego miozyny II.32 Zapytaliśmy zatem, czy zwiększona przepuszczalność IEC po ligacji apikalnie wyrażonej ICAM-1 była zależna od MLCK. Rzeczywiście, usieciowanie ICAM-1 za pomocą Ab spowodowało fosforylację MLCK (Tyr 464), co jest zgodne z aktywacją MLCK (Figura 4c). Aktywacji tej towarzyszyło zmniejszenie apikalnej szczoteczki i peryferyjnej F-aktyny (Figura 4d), wskazujące na reorganizację cytoszkieletu aktyny. Co ważne, hamowanie fosforylacji MLCK indukowanej ligacją ICAM-1 w komórkach T84 za pomocą ML-7 (20 μM,33 Supplementary Figure S4C) zapobiegło reorganizacji F-aktyny indukowanej ICAM-1 (Figura 4d), zmniejszeniu TER (Figura 4a) i zwiększeniu parakomórkowego strumienia dekstranu (Figura 4b). Samo leczenie ML-7 (20 μM) nie miało wpływu na TER. Łącznie dane te sugerują, że w warunkach zapalnych kontakt PMN z apikalną powierzchnią komórek nabłonka krypt wyzwala zdarzenia sygnalizacyjne zależne od ICAM-1, co skutkuje zwiększoną przepuszczalnością.

Zaangażowanie ICAM-1 na apikalnej błonie nabłonkowej ułatwia zwiększoną TEM PMN

Jako że ligacja apikalnej ekspresji ICAM-1 zwiększyła przepuszczalność nabłonka, przeprowadziliśmy eksperymenty w celu zbadania, czy ICAM-1-zależne zmiany w funkcji bariery nabłonkowej spowodują zwiększoną TEM PMN. Najpierw zbadaliśmy, czy zaangażowanie PMN w ICAM-1 na błonie apikalnej IEC wpłynęło na TEM PMN w fizjologicznie istotnym kierunku od strony podstawnej do apikalnej.34 W tych doświadczeniach PMN były stymulowane do migracji przez monowarstwy nabłonkowe, a transmigrujące komórki były zbierane i ponownie nakładane na 1 h na apikalną powierzchnię nowych monowarstw nabłonkowych (2,5 × 105 PMN na monowarstwę) z lub bez wstępnego traktowania IFNγ. Po 1 h kontaktu PMN-nabłonek, monowarstwy przemywano bez przylegających PMN i używano do kolejnych testów TEM PMN w kierunku od podstawno-bocznego do apikalnego. Apikalne wprowadzenie PMN do monowarstw nabłonkowych traktowanych IFNγ, ale nie do monowarstw nie traktowanych, wywołało znaczący wzrost PMN TEM (1,7-krotny, Figura 5a). Samo traktowanie IFNγ lub obecność PMN w pobliżu powierzchni apikalnej, ale bez bezpośredniego kontaktu z monowarstwami, nie miało wpływu na PMN TEM (Figura 5a). W równoległych eksperymentach badano TEM PMN po swoistym usieciowaniu ICAM-1 za pomocą Ab-mediated. Zgodnie z wpływem sieciowania ICAM-1 na funkcję bariery IEC, sieciowanie ICAM-1 za pomocą Ab na T84 IEC poddanych działaniu IFNγ znacząco zwiększyło TEM PMN (1,9±krotnie, Figura 5b) w porównaniu z sieciowaniem apikalnie wyrażonej cząsteczki kontrolnej, MHC-1. Zgodnie z oczekiwaniami, zastosowanie protokołów sieciowania ICAM-1 do nietraktowanych monowarstw IEC nie miało znaczącego wpływu na PMN TEM. Łącznie, wyniki te sugerują, że PMN przylegające do apikalnej (luminalnej) błony IEC poprzez zaangażowanie ICAM-1 mogą wywoływać zmiany w funkcji bariery nabłonkowej i przyczyniać się do regulacji rekrutacji PMN.

Sieciowanie ICAM-1 spowodowało aktywację MLCK, sugerując skurcz aktyny-miozyny (Figura 4). Dlatego następnie zbadaliśmy wpływ inhibicji MLCK i hamowania sił kurczliwych F-aktyny na TEM PMN po sieciowaniu ICAM-1. Zwiększona TEM PMN indukowana przez sieciowanie ICAM-1 została odwrócona, gdy IECs były wstępnie traktowane inhibitorem MLCK ML-7 (20 μM, 1 h33) lub inhibitorem motoru miozyny II, Blebbistatin (10 μM, 1 h,35 Figura 5c). Wyniki te sugerują rolę skurczu aktomiozyny poniżej ICAM-1 w regulacji TEM PMN. Leczenie ML-7 lub samą belebistatyną nie miało wpływu na PMN TEM (Figura 5c).

Ab-mediowana ligacja ICAM-1 w świetle jelita myszy prowadzi do zależnego od MLCK wzrostu przepuszczalności nabłonka i zwiększonej rekrutacji PMN

Następnie przeprowadziliśmy eksperymenty in vivo, aby zbadać wpływ ligacji ICAM-1 na funkcję bariery nabłonka jelitowego i rekrutację PMN, używając modelu pętli jelitowej myszy (Figura 6b). W tym modelu oceniano przepuszczalność nienaruszonych, zakrwawionych segmentów jelita cienkiego po wprowadzeniu dekstranu FITC do światła jelita. Jak pokazano na Figurze 6a, chociaż ICAM-1 nie został wykryty w niestymulowanym nabłonku (górny panel), dootrzewnowe (i.p.) podanie IFNγ i TNFα (500 ng, 24 h) spowodowało silną indukcję ekspresji ICAM-1. W szczególności, indukowany ICAM-1 zlokalizował się do apikalnych regionów kryptowych IECs myszy powyżej Claudin-2 (Figura 6a, dolny panel). Równolegle zaobserwowaliśmy, że leczenie cytokinami spowodowało ∼2-krotny wzrost przepuszczalności 3-kDa FITC-dextranu (Figura 6c).

Co ważne, wprowadzenie Abs do sieciowania ICAM, ale nie Abs do białka kontrolnego, MHC-1 do światła stymulowanych cytokinami pętli jelitowych indukowało dalszy ∼ 1,5-krotny wzrost przepuszczalności dla dekstranu w porównaniu z samym leczeniem cytokinami (Figura 6c). Aby potwierdzić, że wzrost przepuszczalności nabłonka jelitowego był mediowany specyficznie przez nabłonkowe zdarzenia sygnalizacyjne indukowane ICAM-1, użyliśmy peptydów pochodzących z cytoplazmatycznej domeny ICAM-1 (peptyd ICAM-1), aby zahamować zdolność ICAM-1 do pośredniczenia w zdarzeniach sygnalizacyjnych downstream. Wcześniej wykazano w śródbłonku naczyniowym, że ICAM-1, ale nie peptyd kontrolny, hamował interakcje między ICAM-1 a białkami docelowymi, zapobiegając w ten sposób sygnalizacji zależnej od ICAM-1 bez wpływu na wiązanie się z pozakomórkowymi ligandami leukocytów.22, 24 Dodanie ICAM-1, ale nie peptydu kontrolnego (100 μg ml-1, 30 min), hamowało indukowany ligacją ICAM-1 wzrost przepuszczalności jelit (Figura 6c). Abs wprowadzone intraluminalnie do pętli jelitowych (niestymulowanych i po aktywacji IFNγ/TNFα) potwierdzono, że nie przekraczają nabłonka, wykluczając w ten sposób potencjalny pośredni udział komórek lamina propria w obserwowanych efektach (Supplementary Figure S6).

W dalszym poparciu roli MLCK w sygnalizacji pośredniczonej przez ICAM-1, zahamowanie aktywacji MLCK za pomocą ML-7 (1 mg kg-1, i.p.36) przed usieciowaniem ICAM-1.) przed sieciowaniem ICAM-1 zapobiegło wzrostowi przepuszczalności (Figura 6c). Dane te pokazują, że zwiększona przepuszczalność nabłonka jelitowego in vivo po ligacji ICAM-1 jest zależna od MLCK.

Ponieważ zwiększona przepuszczalność nabłonka wiąże się ze zwiększoną migracją PMN, zapytaliśmy, czy ligacja ICAM-1 doprowadziłaby do zwiększonej rekrutacji PMN in vivo. Używając modelu pętli jelitowej u myszy, infiltrację PMN do błony śluzowej jelita i migrację do światła indukowano luminalnym podaniem chemoatraktanta CXCL1 (1 μM w 200 μl zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS)+) i oceniano ilościowo za pomocą znakowania immunofluorescencyjnego / mikroskopii ogniskowej i analizy wypłukiwanego płynu przygotowanego na cytospinach i barwionego Diff-Quik, odpowiednio. Przy braku chemoatraktanta nie wykrywano PMN w nabłonku jelitowym ani w świetle jelita (nie pokazano); jednak luminalne podanie CXCL1 wywołało znaczącą migrację PMN do warstwy nabłonkowej (Figura 7a) i akumulację w świetle jelita (Figura 7c). Zgodnie z indukowanym przez cytokiny wzrostem przepuszczalności, leczenie IFNγ/TNFα zwiększyło ∼ 2,2-krotnie liczbę PMN w nabłonku jelitowym i ∼ 1,7-krotnie w świetle. Co ważne, dodanie Abs sieciującego ICAM-1 do światła pętli jelitowych poddanych działaniu cytokin jeszcze bardziej zwiększyło (w porównaniu do samego leczenia cytokinami) liczbę PMN zarówno w nabłonku (∼ 1,6-krotnie, Figura 7a,b), jak i w świetle (∼ 1,4-krotnie, Figura 7c,d). PMN (zielony) infiltrujące nabłonek jelitowy (czerwony) są pokazane na reprezentatywnych obrazach przekrojów tkankowych z aktywowanych cytokinami pętli jelitowych po ligacji ICAM-1 (Figura 7b). Podobnie PMN, które migrowały do światła po podwiązaniu ICAM-1, są pokazane na reprezentatywnych obrazach płynów z płukania pętli jelitowych (Figura 7d).

Zgodnie z indukowanym przez ligację ICAM-1 wzrostem przepuszczalności nabłonka, zwiększona migracja PMN do światła jelita była zależna od zdarzeń sygnalizacyjnych pośredniczonych przez ICAM-1 i aktywacji MLCK. Zarówno śródścienne dodanie peptydu ICAM-1, ale nie peptydu kontrolnego (nie pokazano; 100 μg ml-1, 30 min), jak i zahamowanie MLCK (ML-7, 1 mg kg-1, i.p.) przed Ab-mediated crosslinking of ICAM-1 całkowicie zahamowało indukowane ligacją ICAM-1 zwiększenie migracji PMN (Figura 7a,c). Wyniki te sugerują, że zaangażowanie ICAM-1 na apikalnej błonie nabłonka jelitowego w warunkach zapalenia upośledza funkcję bariery, ułatwiając w ten sposób zwiększoną rekrutację PMN in vivo.

.