A variação genética dos diferentes estádios de desenvolvimento do Schistosoma japonicum: a distribuição em caracóis e a preferência de emparelhamento beneficiam a transmissão?
Recolha de amostras
Acolha de amostras e o desenho experimental estão resumidos na Fig. 1. As etapas de coleta da amostra são descritas abaixo, incluindo coleta de caramujos, coleta de cercaria, infecção de camundongos e coleta de vermes adultos e coleta de milagídios.
Flowchart de coleta de amostras e desenho experimental
Recolha de caracóis
Os caracóis Oncomelania hupensis foram coletados em março e setembro de 2016 na área leste do Lago Dongting (29° 32′ 5.25″ N, 112° 52′ 35.00″ E), província de Hunan, China. Os caracóis estavam localizados em valas em 3 aldeias a uma distância de 10 km. O local de coleta é um pântano e não um parque nacional ou outra área protegida ou terra privada. As coletas foram realizadas com a permissão e assistência do Instituto de Controle da Esquistossomose da Província de Hunan, China, que supervisiona o controle dos caramujos na área. A Oncomelania hupensis não é uma espécie ameaçada ou protegida. Os caracóis foram trazidos de volta ao laboratório e classificados como Grupo A para os coletados em março e Grupo B para os coletados em setembro. Após um mês de cativeiro, os caracóis foram lavados e transferidos para frascos individuais cheios de água durante 3 h sob luz a 25 °C, para estimular o aparecimento de cercarias para a identificação da infecção pelo S. japonicum. Finalmente, 20 caracóis do grupo A e 25 caracóis do grupo B foram identificados como infectados com o S. japonicum.
Cercaríase coletada
Após a liberação de cercaria de caramujos individuais, alguns foram transferidos para um prato usando um laço e lavados em solução de lavagem de cercariae (5 g/l de hidrolisado de lactoalbumina, 6,8 g/l de NaCl, 0,4 g/l de KCL, 0,2 g/l de CaCl2, 0,2 g/l de MgSO4-7H2O e 1 g/l de glicose) sob microscopia. Após 3 lavagens, os cercariae foram pipetados individualmente com 2 μl solução de lavagem esterilizada em um cartão FTA Whatman™ (GE Healthcare, Pittsburgh, EUA). Após a secagem, os cartões foram armazenados em um saco plástico selado em um dessecador à temperatura ambiente. Pelo menos 50 cercariae por caracol foram coletados individualmente e armazenados em cartões FTA Whatman™.
Infecção por cercariae de caracol individual
Para distinguir caracóis infectados por S. japonicum de um só sexo, 2 ratos de laboratório Kunming foram infectados percutaneamente com 30 cercariae de cada caracol por camundongo. No total, 40 ratos foram infectados durante 20 caracóis do grupo A, e 50 ratos foram infectados durante 25 caracóis do grupo B. Os vermes foram recuperados das veias mesentéricas de cada rato por perfusão usando NaCl 0,9% e dissecção 7 semanas depois da infecção. Tomou-se o cuidado de minimizar o potencial de divisão de vermes adultos emparelhados causados pela força mecânica durante a perfusão e dissecção, usando 3 técnicos experientes para processar os vermes o mais rapidamente possível. Cada par de vermes foi transferido para tubos separados para lavagem e marcado imediatamente, e foram armazenados em etanol absoluto em pares uma vez que se separaram espontaneamente. Os vermes não reparados de cada rato foram verificados ao microscópio para confirmar o sexo e depois armazenados em etanol.
Infecção de ratos com cercariae agrupados de todos os caracóis (Método I e II) e recolha de vermes adultos
Para infecções subsequentes, 17 dos 20 caracóis do Grupo A e 16 dos 25 do Grupo B permaneceram vivos e capazes de produzir cercariae suficiente. Para os dois grupos de caramujos foram utilizados dois métodos diferentes de agrupamento de cercarias. Para os 17 caracóis restantes do Grupo A, todos os caracóis foram reunidos num frasco contendo água para estimular o surgimento de cercarias (Método I). Trinta e um ratos foram então infectados percutaneamente com 34 cercariae para cada rato. Para a infecção usando 16 caracóis do Grupo B, 2 cercarias de cada caracol descascado individualmente foram agrupadas, e as 32 cercarias mistas foram usadas para infectar um rato (Método II), replicando-se para infectar 22 ratos no total. Todos os ratos foram sacrificados para coletar vermes S. japonicum 7 semanas pós-infecção, como descrito acima. Finalmente, 530 vermes de ratos pelo Método I (Grupo A), 484 vermes de ratos pelo Método II (Grupo B) foram coletados.
Recolha de Miracidia
Antes de todos os ratos infectados serem sacrificados para coletar vermes adultos, fezes de cada rato foram coletadas por 7 dias, para concentrar ovos excretados através do intestino para eclosão de milagres. Os sedimentos dos ovos de cada rato foram expostos a água desclorada num frasco sob luz a 25 °C para eclodir milacidia. Miracidia foram colhidos da água superior de cada frasco por uma pipeta e transferidos para um prato com solução de lavagem de miracidium (5 g/l de hidrolisado de lactoalbumina, 6,5 g/l de NaCl, 0,14 g/l de KCl, 0,12 g/l de CaCl2 e 0,20 g/l de NaHCO3). Após 3 lavagens, os milacídios foram pipetados individualmente com 2 μl solução de lavagem esterilizada em um cartão FTA Whatman™. Depois de seco, o cartão foi armazenado em um saco plástico selado em um exsicador à temperatura ambiente. Pelo menos 50 milacídios por fezes de rato foram recolhidos.
Miracidia eclodida de ovos capturados em fígados de ratos infectados também foram recolhidos da seguinte forma. O fígado de cada rato infectado foi coletado após a coleta de vermes adultos, homogeneizado em NaCl frio 1,2%, e filtrado para obter o sedimento do ovo. Miracidia foram chocados usando o mesmo método utilizado para a amostra de fezes. Finalmente, pelo menos 50 miracidia por fígado de rato foram pipetados individualmente e armazenados em cartões FTA Whatman™.
Exploração de DNA genômico
Para o DNA de uma única amostra de cercaria ou miracidium, um disco de 2 mm de diâmetro foi removido do centro de cada área de pipetagem de amostra de um cartão FTA Whatman™ usando um Harris Micro-punch de 2 mm (GE Healthcare Life Sciences, Stevenage, UK). O disco foi colocado na base de um poço 96, 1,2 ml de placa de fundo em U. Após uma lavagem com 100 μl reagente de purificação FTA (GE Healthcare Life Sciences) durante 5 minutos seguido de 100 μl tampão TE (10 mM Tris-Cl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0), 14 µ de NaOH 0,1 M com EDTA 0,3 mM, foi adicionado pH 13,0 a cada poço e a solução deixada a incubar durante 5 minutos, após o qual foi adicionado 26 µl de tampão Tris-HCl 0,1 M, pH 7,0. Em seguida, a placa foi misturada por pulsação com um misturador vortex 3 vezes durante aproximadamente 10 s cada. A solução foi então deixada à temperatura ambiente durante 10 min, pulsada 10 vezes, e o eluato foi transferido para uma placa limpa de 96 poços, e armazenado a – 20 °C para uso posterior.
Como para vermes adultos individuais, a parte anterior, incluindo o útero, foi cortada sob microscopia de cada verme fêmea adulta para evitar a influência dos ovos no útero sobre o genótipo do verme fêmea. Enquanto os vermes machos inteiros ou os vermes fêmeas imaturas foram usados para extracção de ADN. O ADN genómico total foi extraído individualmente de cada verme usando um procedimento padrão de dodecilsulfato de sódio-proteinase K, como se segue. Cada verme foi incubado e descongelado em 400 μl tampão de extracção contendo 50 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1% SDS, e 100 mg/ml de proteinase K, a 56 °C durante 1 h com mistura suave. O DNA em solução foi extraído utilizando fenol/clorofórmio padrão de purificação, seguido de acetato de sódio 3 M (pH 5,2) e precipitação de etanol. Pellets de DNA foram lavados em etanol 70%, secos ao ar e ressuspendidos em 20 μl TE (pH 8,0), armazenados a – 20 °C como extrato de DNA bruto de vermes adultos para uso posterior.
Amplificação de PCR e genotipagem por microsatélite
Para confirmar a existência de ADN genómico na eluição de cartão FTA ou extracto bruto de amostra de etanol armazenado, o fragmento de ADN ribossómico 28S foi amplificado a partir da solução de ADN de um único cercaria, miracidium, ou verme adulto, usando os seguintes iniciadores: para frente (5′-GTG GAG TTG AAC TGC AAG C-3′) e para trás (5′-GCT CAA CAW TAA TAG TCA AAC CTG-3′). Os PCRs foram realizados usando o Illustra PuReTaq Ready-To-Go PCR Beads em uma placa de 96 poços (GE Healthcare Life Sciences, EUA). Para cada gota, foram adicionados 2 µl de eluição de FTA de larva única ou 0,5 µl de extracto bruto de um único verme, com 1 µl de cada primário, e água até um volume final de 25 µl. A amplificação foi implementada com o seguinte programa: 95 °C durante 5 min; seguido de 40 ciclos de 30 s a 95 °C, 30 s a 60 °C, e 40 s a 72 °C; e um passo final de extensão a 72 °C durante 7 min. As reacções foram então verificadas executando 5 µl num gel de TAE de agarose a 2%.
Genotipagem em pequena escala foi feita para 30 cercariae, 30 miracidia, e 30 vermes que foram escolhidos aleatoriamente, para construir um painel multiplex óptimo de loci de microsatélite para amplificação PCR. Vinte loci desenvolvidos e validados em estudos anteriores e do nosso laboratório foram verificados. Finalmente, 9 microsatélites loci (arquivo adicional 1: Tabela S1) foram selecionados para formar o painel. Os microsatélites loci para cada amostra de DNA foram genotipados usando o kit de PCR tipo Microsatellite (Qiagen, Manchester, UK) com o multiplex de 9 loci. O primer forward de cada par foi rotulado com um corante fluorescente apropriado, incluindo 6-FAM, HEX, TAMRA, e ROX (arquivo adicional 1: Tabela S1). As reacções PCR foram preparadas numa placa PCR de 96 poços usando 6,25 µl de 2× master mix, 1,25 μl solução Q, 0,5 μl primers (10 μM), 2 μl modelo de ADN, e 2,5 μl ddH2O, depois realizadas num termociclador Bio-Rad com o seguinte programa: 95 °C durante 5 min; seguido de 35 ciclos de 30 s a 95 °C, 90 s a 60 °C e 3 min a 72 °C; seguido de um passo final de extensão a 60 °C durante 45 min. As reacções PCR foram verificadas executando 5 µl num gel de agarose TAE 2%, e as amplificações bem sucedidas foram enviadas para Sangon Biotech (Xangai, China) para análise de fragmentos num analisador genético ABI3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Os genótipos foram pontuados usando um plugin de microsatélite de Geneious 11.0 . Todas as amostras foram amplificadas e genotipadas duas vezes para reduzir o desvio. No total, genótipos de 346 cercariae, 701 vermes adultos e 393 miracidia foram gerados para as seguintes análises.
Análises de diversidade genética
A diversidade genética de cada locus foi estimada em todos os cercariae genotipados através do cálculo do número de alelos (Na) observado, o número efetivo de alelos (Ae) no GenAlEx 6.5 e riqueza alélica (Ar) e diversidade genética (Hs) no hierfstat ver. 0,04-22 , incluindo 156 cercariae de 20 caracóis do Grupo A e 190 cercariae de 25 caracóis do Grupo B. O desvio do equilíbrio de Hardy-Weinberg (HWE) para cada locus foi testado com o teste Qui-quadrado no GenAlEx, e o teste de desequilíbrio de ligação entre loci foi calculado em SHEsis .
O Na, Ae, Ar e Hs foram calculados para diferentes populações durante o processo de infecção de camundongos da seguinte forma Para populações cercariadas utilizadas na infecção, 132 cercariadas de 17 caracóis do grupo A (utilizado no Método I) e 122 cercariadas de 16 caracóis do grupo B (utilizado no Método II) foram avaliadas. Após a genotipagem e filtragem de dados de baixa qualidade, pelo menos 5 pares de vermes adultos (quando presentes) e todos os vermes não pareados de cada rato foram genotipados com sucesso. No total, 357 vermes de camundongos do Método I (usando cercarias de 17 caracóis do Grupo A), 344 vermes de camundongos do Método II (usando cercarias igualmente mistas de 16 caracóis individuais do Grupo B) foram envolvidos. Além disso, a diversidade genética dos vermes adultos em cada rato foi estimada para verificar a consistência alélica dos vermes adultos entre os ratos nos Métodos I e II separadamente. Para populações de miracidium, a diversidade genética de miracidia do fígado e fezes foi calculada ao nível da suprapopulação (miracidia de fígado ou fezes de todos os ratos), devido a apenas 3-4 miracidia do fígado ou fezes em cada rato foram genotipados, incluindo 93 miracidia de fígado (3 por rato) e 124 miracidia de fezes (4 por rato) no Método I, e 88 miracidia de fígado e fezes (4 por rato separadamente) no Método II.
Análise de variância molecular (AMOVA)
A diferenciação genética de todos os cercariae genotípicos do Grupo A e do Grupo B foi estimada usando AMOVA no verso Arlequim. 3.5.2.2 . Após excluir os caramujos não utilizados para infecções de ratos, foi testada a diferenciação entre 132 cercarias de 17 caramujos do Grupo A (para o Método I) e 122 cercarias de 16 caramujos do Grupo B (para o Método II). Após a infecção, foi testada a diferenciação entre 357 vermes adultos no Método I e a população cercariae original (132 cercariae do grupo A). Também, os 344 vermes do Método II foram testados contra os 122 cercariae do grupo B. Além disso, a variação de vermes adultos entre 31 ratos do Método I e vermes adultos entre 22 ratos do Método II foram avaliados separadamente. Para miracidia, a diferenciação genética foi testada entre 93 miracidia de fígado e 124 miracidia de fezes no Método I, e o mesmo para 88 miracidia de fígado e fezes no Método II.
Análise de parentesco para singletons de cercariae com niMLG
O número de genótipos de cercaria de cada caracol foi contado. Como é difícil distinguir erros de digitação ou mutação somática durante a multiplicação de esporócitos do genótipo miracidium original, um grupo de genótipos de cercariae com menos de 2 alelos desencontrados foram identificados como niMLGs e atribuídos a uma linhagem derivada do mesmo miracidium em cada caracol. Finalmente, o número de milagres que estabeleceram clones genéticos em cada caracol foi avaliado com base no número da linhagem usando o alelematch ver do pacote R. 2.5 .
Since cercariae com niMLGs em um caracol foram presumidos como derivados de um miracidium , um dos genótipos (singleton) para niMLGs foi designado para representar um grupo de cercariae que se originou de um miracidium com a função amCluster em alelematch, para produzir o conjunto de dados filtrados para análise de parentesco entre miracidia. Então, o parentesco entre singletons (miracidia) foi estimado usando o coeficiente de correlação do tamanho do alelo (I′) de acordo com Streiff em SPAGeDi ver. 1,5a a nível intra-caracol e entre caracóis para 20 caracóis do Grupo A e 25 caracóis do Grupo B, para descobrir se a agregação de miracidia num caracol estava correlacionada com a similaridade genética da miracidia.
Distância genética entre vermes adultos femininos e masculinos
Para detectar uma potencial preferência genética pelo S. japonicum durante o acasalamento, a distância genética inter-individual Dsw entre o macho e a fêmea de cada par em ratos individuais foi medida com o ver Populações. 1.3.32 (http://www.bioinformatics.org/~tryphon/populations/), e comparada com a distância genética entre a fêmea pareada e a não pareada (se disponível, a não pareada é maioritariamente masculina) no mesmo hospedeiro.
Paternidade de identificação para miracidia
As frequências alélicas de todos os vermes adultos e miracidia em cada rato foram analisadas e calculadas usando a função de Análise de Frequência Alleal em Cervus 3.0 . Todos os 9 loci foram finalmente avaliados como marcadores adequados para posterior análise de parentesco com uma probabilidade combinada de não-exclusão inferior a 0,01%. A função Simulação da Análise de Parentesco foi aplicada com base na freqüência dos alelos, para estimar o poder de resolução dos loci codominantes e os valores críticos da probabilidade de log-likelihood (LOD) com as seguintes suposições: 10.000 descendentes (miracidia) para cada rato individualmente; 10 mães e pais candidatos em cada rato (estimativa do tamanho da amostra de acordo com o número de vermes adultos recolhidos num hospedeiro); a proporção de candidatos foi definida para 100% de vermes adultos genotipados; outras opções foram definidas por defeito. Finalmente, ambas as saídas da Análise de Frequência Única e Simulação de Análise de Pais foram referidas no módulo Análise de Pais, para atribuir cada descendência aos seus pais mais prováveis. Os pais que têm mais de 2 alelos desencontrados com descendentes foram excluídos, e aqueles que tinham o maior LOD foram considerados como os pais mais prováveis.
Análise Estatística
Todos os dados usados na análise estatística neste estudo são dados contínuos. A significância da diferença nos índices de diversidade genética (Na, Ae, Ar e Hs) de loci, coeficiente de parentesco (I′), e distância genética interindividual (Dsw) entre dois grupos foram avaliados com o nível de significância de 0,05. Em primeiro lugar, a distribuição normal dos conjuntos de dados foi verificada com o teste Sharpiro-Wilk. A seguir, aplicou-se o teste t de amostras pareadas/independentes quando os conjuntos de dados atingiram a distribuição normal. Caso contrário, o teste de Wilcoxon assinado e o teste Mann-Whitney U-test foram aplicados para as amostras relacionadas/independentes. A correção de Bonferroni foi usada para corrigir o valor P em comparações múltiplas.