ClorofórmioDeuterado
13.4.4 Avaliar e manter o desempenho do instrumento
Incorporação de instrumentos de laboratório em sistemas de gestão da qualidade usados para certificações de laboratório (ou seja, ISO17025 para laboratórios analíticos) requer a avaliação e manutenção do desempenho do instrumento em intervalos regulares. Estas certificações permitem ao cientista analítico do laboratório criar testes de qualificação de operação (OQ) e de qualificação de desempenho (PQ) em torno do uso pretendido do instrumento. Assim, para NMR, os testes OQ/PQ podem variar dependendo dos testes analíticos comuns a serem realizados no instrumento. Os instrumentos modernos possuem procedimentos automáticos que exigem que o usuário insira a amostra apropriada, então uma série de testes é realizada de forma automatizada. No final destes testes, é emitido um relatório que permite ao utilizador avaliar o desempenho global do espectrómetro.
Para testar a terapêutica de proteínas em soluções aquosas, estes testes de OQ devem incluir: calibração da temperatura, linha no sinal de acetona em clorofórmio deuterado, sensibilidade nos sinais de etilbenzeno em clorofórmio deuterado e/ou supressão de água com avaliação da sensibilidade nos prótons anoméricos de uma solução de sacarose de 2 mM. A calibração da temperatura é importante porque a dinâmica de uma proteína é impactada pelas condições da solução ambiente, o que pode ter grandes efeitos sobre as larguras e frequências de linha de sinal observadas. A regulação da temperatura da amostra nos espectrômetros NMR depende do controle cuidadoso da temperatura e da vazão do ar da sonda. O impacto do ar da sonda na temperatura da amostra pode ser medido através da medição dos desvios químicos de uma solução 100% metanol ou 100% etilenoglicol. Estes desvios foram cuidadosamente medidos para que a temperatura real da amostra possa ser avaliada com um determinado ajuste de temperatura e vazão do ar da sonda.
O impacto de ter um bom tremor da amostra (ou seja, um campo magnético uniforme através da parte observada de uma amostra) sobre a qualidade espectral não pode ser exagerado: quanto mais estreitos forem os picos, melhor será a resolução e a sensibilidade dos sinais a serem medidos. Especificamente, se forem usadas técnicas de supressão de sinais, quanto mais estreita for a base do pico a ser suprimido, melhor será a presaturação ou técnicas de supressão seletiva de sinais em banda estreita. Felizmente, o advento das técnicas de mapeamento de campo e de gradiente de cintilação simplificou esta tarefa muitas vezes demorada de ajustar os ajustes de cintilação para cada amostra. Entretanto, haverá amostras para as quais os mapas de calço não funcionarão bem, e será necessário gastar tempo no ajuste do calço para obter uma resposta ótima do instrumento.
Avaliação da sensibilidade do espectrômetro com amostras padrão é uma maneira ideal de acompanhar o desempenho do sistema e os valores obtidos nos testes padrão devem atender ou exceder as especificações do espectrômetro definidas pelo fabricante. Note-se que as especificações do espectrômetro são frequentemente definidas de forma conservadora pelo fabricante para garantir que seu instrumento passe nestes testes na instalação. Entretanto, a execução dos testes OQ/PQ em intervalos regulares permite que o proprietário do espectrômetro se familiarize com as capacidades de seu instrumento particular. O desvio do conjunto de valores estabelecidos pelos testes de rotina deve ser examinado cuidadosamente, pois pode ser uma indicação de mau funcionamento do instrumento.
No caso da análise de pequenas moléculas em solventes orgânicos, o uso do sinal de acetona em clorofórmio deuterado para alcançar não apenas uma linha Lorentziana e um FWHH estreito, mas uma base estreita (por exemplo, <20 Hz nos 20% do sinal do satélite 13C) geralmente leva à melhor sensibilidade em sinais de etilbenzeno em clorofórmio deuterado. Para espectrômetros usados para obter espectros em soluções aquosas, uma segunda medida de sensibilidade é mais importante: a capacidade do espectrômetro de obter boa sensibilidade e resolução a partir de sinais próximos ao pico de água. Assim, a medida de sensibilidade com os sinais de prótons anoméricos de um padrão composto de 2 mM de sacarose em solução 95% H2O/5% D2O com supressão de água aplicada é uma medida mais realista do desempenho sinal-ruído do espectrômetro para NMR de amostras terapêuticas de proteínas.
Para um PQ em um espectrômetro avaliando a qualidade da terapêutica protéica, um atributo de qualidade crítico desses medicamentos é uma estrutura terciária específica conferida pelo dobramento da cadeia de aminoácidos. Portanto, como uma PQ em um espectrômetro realizando análise de mapa de estrutura 2D, os espectros 2D-HSQC podem ser executados em um curto período de tempo em uma amostra 15N ou 13C-isotopicamente enriquecida para estabelecer a capacidade do espectrômetro de realizar programas de pulso com esquemas de desacoplamento eficientes e seleção de gradiente de coerência. As soluções padrão 13C ou 15N isotopicamente enriquecidas (por exemplo, proteína de domínio SH3 ou ubiquitina) em tubos selados estão disponíveis comercialmente em concentrações que permitem que os dados sejam coletados em poucas horas. Espectrômetros adequadamente calibrados em 500 MHz e acima, e equipados com uma sonda criogênica podem medir mapas de estrutura 2D em abundância natural (ou seja, não isotopicamente enriquecidos) proteínas em ∼1.0 concentração mM em 2-3 dias de tempo de espectrômetro .