Nutrófilos transmigrados no lúmen intestinal atacam o ICAM-1 para regular a barreira epitelial e o recrutamento de neutrófilos
ICAM-1 promove a adesão de PMN e locomoção na membrana epitelial apical sob as condições de inflamação
Em abcessos criptográficos, Como observado na DII ativa, o PMN infiltrando as criptas intestinais é frequentemente observado em contato íntimo com a superfície epitelial apical (luminal).14 Para examinar as interações PMN-IEC durante os estágios finais do TEM, modelamos a migração de PMN através do epitélio intestinal sob condições inflamatórias usando uma configuração transwell previamente descrita.19 O TEM de PMN na direção fisiológica basolateral-apical através do controle ou interferon-γ (IFNγ)-tratado T84 IECs foi induzido pela adição de um gradiente transepitélico N-formil-Met-Leu-Phe (fMLF) (100 nM). A exposição do T84 IECs ao IFNγ (100 U ml-1, 24 h) não teve efeito significativo na função da barreira IEC ou expressão e localização subcelular das proteínas juncionais chave JAM-A, Occludin, e ZO-1 (Figura Suplementar S1 online). O tratamento IFNγ não teve efeito significativo no número de PMN que completaram o TEM; entretanto, aumentou significativamente o número de PMN apicamente associados (de 8,7±1,8%, sem tratamento, para 19,7±1,9%, IFNγ, apical, Figura 1a). Consistente com este aumento, o número de PMN não-migrado (PMN na câmara superior, basal) foi significativamente reduzido (∼1,5 vezes) após o tratamento IFNγ, sugerindo um aumento da taxa de migração (Figura 1a). O número de PMN dentro da monocamada epitelial (epitélio) não foi alterado. Imagens representativas de imunofluorescência confocal (Figura 1b, painéis superiores) e z-projeções (painéis inferiores) mostram PMN apicalmente associado após migração através do IFNγ estimulado, mas não controla as monocamadas T84. Como o IFNγ demonstrou anteriormente induzir a expressão do ICAM-1 no epitélio inflamado,27 nós colocamos a hipótese de que durante a inflamação, o PMN migrando através das monocamadas epiteliais permaneceu aderente à membrana apical através das interações Mac-1 e ICAM-1-dependente, e portanto seria capaz de locomoção dependente do ICAM-1 como foi previamente observado no endotélio vascular.24, 28 Confirmando resultados anteriores, o tratamento IFNγ (100 U ml-1, 24 h) induziu um aumento robusto e dependente do tempo na expressão ICAM-1 (pico de 24 h após o tratamento, Figura 1c,d) na membrana apical do T84 IECs (Figura 1e). Este efeito foi específico para IFNγ, pois a exposição das IECs T84 e SKCO15 ao fator de necrose tumoral-α (TNFα; 10 ng ml-1) falhou em induzir a expressão ICAM-1 (Figura Complementar S2A,B). A upregulação do ICAM-1 também foi observada no epitélio criptográfico das biópsias do cólon de pacientes com colite ulcerativa ativa em comparação com a mucosa saudável (Figura 1f). Além disso, confirmando a adesão de PMN dependente de ICAM-1 e Mac-1 às membranas IEC apicais, a adição de anticorpos anti-ICAM-1 ou anti-Mac-1 de bloqueio da função (Abs; 20 μg ml-1) reverteu o aumento da adesão de PMN induzido por IFNγ (Figura Suplementar S3A). Curiosamente, a inibição do PMN Mac-1 resultou em uma redução mais potente (>3 vezes) na adesão de PMN comparado com a inibição do ICAM-1, sugerindo que o Mac-1 liga outros ligantes epiteliais de superfície além do ICAM-1.
Examinamos a seguir se o PMN aderiu apicalmente após atravessar o epitélio exibiu locomoção apical. A microscopia de fase-contraste time-lapse foi usada para rastrear e quantificar o comportamento do PMN individual aderido à membrana apical IEC. O PMN na ausência de estímulo exógeno exibiu pouco movimento; entretanto, 59,3±7,6% do PMN apicalmente associado após a migração através de IEC exibiu um comportamento altamente móvel (Figura 2a) com distâncias médias de engatinhar de 65,6±6,2 μm (Figura 2b). O TEM induziu um aumento robusto na expressão Mac-1 na superfície da célula PMN (Figura 2c), consistente com seu papel nas interações apicais PMN-IEC. Importante, o número de PMN exibindo locomoção apical foi significativamente aumentado quando IECs foram estimulados com IFNγ para upregular o ICAM-1 (88±3,6%, IFNγ, vs. 59,3±7,6%, IEC sem tratamento). Sob essas condições, o PMN viajou por distâncias significativamente maiores (101±10,0 μm, IFNγ, vs. 65,6±6,2 μm, IECs não tratadas, Figura 2b) ao longo da membrana epitelial apical. Confirmando o papel do ICAM-1 na mediação da locomoção do PMN, a adição de um anticorpo anti-ICAM-1 (Ab) bloqueador de funções reverteu os efeitos do IFNγ, reduzindo tanto o número quanto as distâncias percorridas pelo PMN (61,4±7,8% e 73,6±6,1 μm, respectivamente, Figura 2a,b). A inibição do Mac-1 aboliu a locomoção do restante do PMN aderente (Figura 2a e Filmes Suplementares S1 e S2), confirmando um papel exclusivo do Mac-1 neste processo. Os efeitos da inibição do Mac-1 na locomoção do PMN são ainda destacados em seqüências de imagens com lapso de tempo (Figura 2d) e por trajetórias de deslocamento de seis PMN representativos (Figura 2e). As velocidades de deslocamento do PMN variaram de 3 a 7 μm min-1 e não foram significativamente diferentes em IECs não estimulados vs. IFNγ (Figura Suplementar S3B).
A adesão de PMN à membrana epitelial apical compromete a função da barreira epitelial
Examinamos em seguida os efeitos das interações de PMN com ligandos epiteliais expressos apicamente sobre a função da barreira epitelial. Nesses experimentos, PMN foram adicionados apicalmente aos confluentes T84 IECs cultivados em suportes permeáveis (0,4 μm tamanho do poro, muito pequeno para permitir PMN TEM), e TER, como um índice de barreira epitelial, foi medido em 12-h sob condições especificadas. O período de 12-h foi selecionado para evitar os efeitos do PMN apoptótico sobre a barreira epitelial.29 A adesão do PMN estimulado por fMLF (100 nM) ao T84 IECs desencadeou uma diminuição dependente do tempo no TER durante um período de 12-h (∼60%, Figura 3a). Importante, a adição de PMN à membrana apical dos IECs T84 que foram pré-tratados com IFNγ, o que mostramos leva a uma maior adesão ao PMN dependente do ICAM-1 (Figura 1a), resultou em um decréscimo adicional na TER (∼90% primeiras 2 h e ∼40% durante 12 h). O tratamento com IFNγ por si só não teve efeito no TER. Para testar se o aumento observado na permeabilidade epitelial foi devido a um contato direto entre células epiteliais e PMN, utilizamos um anti-Mac-1 inibitório Ab (CBRM1/29, 20 μg ml-1) para inibir a adesão de PMN às IECs estimuladas pelo IFNγ. A inibição do Mac-1 atenuou significativamente a diminuição induzida pelo PMN no TER após a estimulação do IFNγ (Figura 3a). É importante notar que em experiências separadas confirmamos que a diminuição induzida pelo PMN na TER tanto em monocamadas epiteliais não estimuladas como em monocamadas epiteliais tratadas com IFNγ foi dependente do contacto directo entre o PMN e a membrana epitelial apical, e não mediada por mecanismos parácrinos. Em tais experiências, os PMNs foram adicionados à câmara inferior de transwells contendo monocamadas T84 invertidas (lado apical virado para baixo) e estimuladas com fMLF (100 nM). Nestas condições, não houve efeito do PMN sobre a barreira epitelial avaliada pelo TER (Figura 3b). A exposição de monocamadas epiteliais a 100 nM fMLF durante 12 h não teve efeito significativo na TER.