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DISCUSSÃO
O sistema do modelo de sintetizador de DNA contém todas as proteínas necessárias para suportar cada fase do processo de replicação de DNA, e essas proteínas variam em tamanho de 20 a 240 kDa sob condições de ensaio atuais, e podem realizar todas as fases do processo de replicação de DNA in vitro . Neste estudo, a atividade de primase do DNA associado à síntese foi caracterizada pelo exame da síntese e extensão dos primers de RNA catalisados in vitro pelo sintetizador de DNA. Os resultados de nossas análises funcionais mostram que a atividade do DNA primase associado à síntese na fração P4 derivada das células cancerígenas da mama é 30 vezes maior que a dos extratos brutos de células cancerígenas da mama. A fração P4, contendo o sintetizador de DNA, foi derivada da combinação de frações de proteínas nucleares e citoplasmáticas solúveis preparadas a partir de células MCF7 e foi utilizada para realizar o ensaio de replicação de DNA SV40 in vitro . As atividades da DNA polimerase α e δ e da DNA primase na fração P4 são 20-40 vezes superiores às dos extratos de células brutas; tornando-a uma ferramenta útil para estes estudos porque é totalmente competente para apoiar a síntese e extensão de primers de RNA em um sistema modelo in vitro que demonstrou suportar todas as fases do processo de replicação do DNA .
DNA primase exibe um processo único na síntese e extensão de primers de RNA. Este processo é definido por uma competição entre a adição do próximo nucleotídeo correto e a dissociação do complexo primer-template. O DNA primase é a única enzima capaz de sintetizar primers de RNA durante o início da síntese do DNA . Nenhuma das subunidades do primase é capaz de sintetizar ou estender um primer de RNA por si só . O sintetizador contém ambas as subunidades primase, (i.e. p49 e p58) e pode catalisar a síntese de primers de RNA in vitro usando um modelo exógeno de poli(dT). O sintetizador sintetiza um primer de RNA funcional de comprimento de unidade (7-10 nt). Estes primers de RNA são completamente hidrolisados por RNase em fragmentos curtos de 1-4 bp, mas eles não são hidrolisados por DNase. A característica distintiva do primase associado ao sintetizador, que o distingue de um primase de DNA isolado, é sua capacidade específica de estender o primer de RNA para formar um filamento de DNA-primer. A síntese de uma cadeia de DNA-primer também requer atividade de DNA polimerase, além da atividade de DNA primase. A atividade da DNA polimerase é normalmente alterada para iniciar o alongamento de um primer de RNA após a síntese do primer. Apenas os iniciadores de RNA ≥7 são utilizados pela polimerase; independentemente da concentração de dNTP . Assim, a síntese e extensão do primer de RNA de comprimento unitário não só requer primase mas também envolve a polimerase do DNA α subunidade p180 , e o sintetizador contém polimerases de DNA altamente activas, que catalisam a incorporação de desoxirribonucleotídeos para estender o primer de RNA. Os primers de RNA são estendidos pelas polimerases associadas à síntese de um oligoprimer de DNA-RNA de 20-40 nt de comprimento (DNA primer). Os filamentos do DNA-primer contêm dois componentes: (1) um ribonucleotídeo de 10 nt e, (2) um desoxirribonucleotídeo de 20-40 nt. O RNase e o DNase hidrolisam separadamente os componentes apropriados das cadeias de DNA-primer, resultando em uma hidrólise mais curta mas incompleta da cadeia de DNA-primer.
Outra característica do sintetizador é a síntese rápida e tamanhos distintos do iniciador de RNA e da cadeia de DNA-primer. O sintetizador catalisa a síntese de um iniciador de RNA e de uma cadeia de DNA e os níveis de estado estável parecem se acumular dentro de (5-15 min). Os tamanhos da unidade de comprimento do primer de RNA (7-10 nt) e da fita de DNA-primer (20-40 nt) catalisada pelo sintetizador de DNA permanecem sempre constantes, independentemente da concentração do sintetizador ou do tempo de reação. Este estudo sobre o mecanismo da atividade do DNA primase implica que a síntese de primers de RNA, catalisada pelo primase associado ao sintetizoma, ocorre através de um início lento, polimerização rápida e terminação “inteligente” do primer . A DNA primase liga o modelo de DNA e lentamente inicia a síntese de um dinucleotídeo. Após a síntese do dinucleotídeo, NTPs adicionais são rapidamente adicionados ao dinucleotídeo polimerizado pela DNA primase. A atividade do DNA primase é caracterizada pela síntese de cada primer de RNA em um único “estouro” de atividade, ao invés de via síntese distributiva. Uma vez que os primers de 7-10 nt de comprimento de unidade foram gerados, o primase-mplaca atua como um sinal de terminação e inibe a síntese adicional de RNA. Esta inibição é devida à geração de um primer-template estável, que provavelmente permanece associado com o complexo pol α-primase. Curiosamente, os filamentos de DNA-primer sintetizados pelo sintetizador de DNA in vitro são similares aos primers de RNA sintetizados in vitro. A síntese de uma fita de DNA-primer atinge níveis estáveis rapidamente e o tamanho da fita de DNA-primer permanece relativamente constante (entre 20 e 40 nt), independentemente do tempo de reação ou da concentração do sintetizador utilizado durante a reação de síntese. A síntese da fita de DNA-primer requer atividade da DNA polimerase α além da DNA primase . Nossos resultados sugerem que a atividade da polimerase associada à síntese α também é caracterizada por uma polimerização rápida e terminação “inteligente” na síntese da cadeia de DNA-primer. A sintetização, com a característica de polimerização rápida e terminação inteligente do DNA-primer, difere da síntese medicada pelo fragmento de Klenow da E. coli DNA polimerase I durante a extensão do primer de RNA. Em contraste com o sintetizador, a extensão do primer de RNA catalisado pela polimerase I depende fortemente da duração do tempo de reação. O aumento do tempo de reação aumenta significativamente a quantidade e tamanho dos primers de RNA estendidos.
Dois mecanismos potenciais foram propostos para contabilizar a mudança da síntese do primer para a extensão do primer durante o processo de replicação do DNA. O primeiro propõe que o complexo primase-polimerase se dissocie do primer-template e se reassocie com o local ativo da polimerase. O segundo propõe que a mudança ocorra em uma translocação intranet do complexo pol α-primase do local ativo da primase para o local ativo da polimerase α. Esta mudança não envolve a dissociação do complexo pol α-primase do modelo de DNA. Nossos experimentos demonstram que a extensão do primer de RNA catalisado de polimerase I é inibida por altas concentrações do sintetizador de DNA. A capacidade do fragmento de Klenow de estender um primer de RNA depende da síntese de primers de RNA catalisados pelo sintetizador, que também precisa de um local de ligação disponível no terminal do primer de RNA. Portanto, o fragmento de Klenow da E. coli polimerase I requer a dissociação do complexo primase-polimerase do primer-template. Entretanto, altas concentrações do sintetizador competem com a polimerase I para o local de ligação no primer-template de modo que a extensão do primer de RNA seja inibida. O sintetizador forma um complexo sem saída no terminal do primer de RNA; resultando na incapacidade do fragmento de Klenow de participar no processo de extensão do primer de RNA. Este resultado sugere que o complexo polimerase-primeiro do sintetizador de DNA deve ser dissociado do primer-template após a síntese do primer de RNA. Nosso resultado mostra que o sintetizador aumenta o tamanho da unidade de comprimento do primer de RNA quando a temperatura de reação é reduzida. Diminuir a temperatura de reação aumenta a eficiência de comutação do complexo polimerase-primeiro e diminui a desnaturação do primer-template. Além disso, a subunidade DNA primase p49 contém a atividade catalítica de RNA polimerase, necessária para aumentar o tamanho da unidade de comprimento do primer RNA. Portanto, nossos resultados sugerem que o DNA synthesome tem a atividade polimerase de RNA apropriada necessária para formar fragmentos de DNA comprimentado por RNA.
A análise cinética da iniciação e alongamento do primer de RNA demonstra que o DNA primase associado ao synthesome é uma enzima lenta e relativamente fraca em relação à ligação do modelo . O DNA primase também é uma polimerase de ácido nucléico propensa a erros, pois esta enzima tem uma capacidade muito fraca de discriminação de nucleotídeos; resultando em má incorporação de nucleotídeos . Portanto, nossa análise da cinética enzimática da atividade de DNA primase associada à síntese poderia ser usada para determinar a relação das taxas de síntese e freqüências de erro durante a síntese de primers de RNA. A síntese descontínua de fragmentos de DNA (Okazaki) na cadeia retardada do garfo de replicação é um processo bioquímico importante durante a replicação do DNA. A fim de assegurar uma coordenação eficaz entre a síntese contínua de DNA no fio condutor e a síntese descontínua de DNA no fio retardatário, a DNA primase requer uma série de etapas enzimáticas precisamente cronometradas que controlam a síntese do primer de RNA. Um estudo cinético de um complexo de replicação multiproteína a partir de bacteriófagos T7 mostra que a primase age como um freio molecular e interrompe transitoriamente a progressão do garfo de replicação. Devido à interação física da DNA polimerase δ com pol α, o resultado apresentado por Lee et al. sugere que a DNA primase pode ser capaz de evitar que a síntese de fios condutores ultrapasse a síntese de fios retardatários durante as etapas enzimáticas lentas do fio retardatário.
Vários modelos de replicação de DNA eucariótico foram usados no estudo da função de DNA primase. O sistema de replicação de matriz nuclear do lisado de células inteiras tem sido usado para examinar a síntese e distribuição do primer de RNA nativo e do DNA nascente do RNA em núcleos de células eucarióticas usando um modelo de DNA de dupla cadeia de matriz nuclear endógena. Os primers de RNA estão estreitamente associados à matriz nuclear de células de mamíferos em rápida proliferação . Os iniciadores de RNA estão covalentemente ligados ao DNA recém-replicado para formar o DNA nascente com o padrão de RNA. O DNA com RNA é degradado em alguns oligoribonucleotídeos de ~10 nt de comprimento após a digestão do DNase, e pelo menos 94% dos primers de RNA nativos e do DNA nascente com RNA estão localizados dentro da fração da matriz insolúvel do núcleo. Primers de RNA de 8-10 nt de comprimento que são encontrados associados com a matriz nuclear, compõem <1% do total de RNA na célula; tornando muito difícil o exame do primer de RNA e do DNA nascente com RNA na fração da matriz nuclear da célula devido a uma concentração muito baixa de primers de RNA e a grande quantidade relativa de outros RNAs. Além disso, o isolamento dos primers de RNA e do DNA nascente impregnado de RNA dos lisados de células inteiras rotulados com radio-nucleotídeos é um procedimento de purificação complicado e não trivial quando aplicado à análise da síntese de primers de RNA mediada por modelo de replicação de matriz nuclear. Em contraste, o DNA sintetizado purificado a partir das frações combinadas nuclear e citoplasmática contém primase de DNA altamente ativo e polimerases de DNA, e suporta totalmente a síntese de primers de RNA nativos in vitro usando um modelo de DNA de dupla cadeia SV40. Os primers de RNA sintetizados de DNA são de comprimento normal (10-20 nucleotídeos) e parecem funcionar corretamente para suportar a extensão do primer pela DNA polimerase. Estes primers de RNA podem ser prontamente estendidos para formar ADN nascente de 100-200 nt comprimentos de RNA. A síntese descontínua de fragmentos de ADN (Okazaki) na cadeia retardada do garfo de replicação é um processo bioquímico importante envolvido na replicação do ADN, e os fragmentos de ADN (Okazaki) comprimentados por RNA e sintetizados pelo sintetizador de ADN são também cerca de 100-200 nucleótidos de comprimento. Observamos que o sintetizador de DNA poderia sintetizar diferentes produtos com RNA primed de tamanho variando de 10 a 200 nt de comprimento. Isto pode ser considerado razoável, uma vez que os primers de RNA nativos e o DNA nascente com RNA são também deste comprimento aproximado. A observação acima, de que a síntese do primer de RNA e do DNA nascente com RNA, catalisado pelo sintetizador de DNA, é essencialmente equivalente à do estudo publicado usando o modelo de replicação de matriz nuclear do lisado de células inteiras, sugere que o sintetizador de DNA é um excelente sistema de modelo capaz de realizar um processo de replicação de DNA fisiologicamente significativo in vitro.
O modelo de sintetizador de DNA é, portanto, uma ferramenta única e valiosa no estudo da função de DNA primase. A síntese mediada pela primase e a extensão da síntese e alongamento do primer de RNA realizado pelo sintetizador de DNA assemelha-se muito ao realizado por outros modelos de replicação sem células. O modelo de sintetizador suporta a síntese e extensão de primers de RNA in vitro usando modelos exógenos de DNA de cadeia única, bem como DNA de cadeia dupla super-revestido contendo uma origem de replicação SV40 intacta. Portanto, o sintetizador de DNA é completamente capaz de mediar a síntese e extensão de primers de RNA in vitro, e pode facilitar a investigação adicional dos mecanismos que iniciam a síntese de DNA em células eucarióticas. Juntos nossos resultados sugerem que o modelo de sintetizador fornece uma ferramenta única para o estudo da interação da DNA primase e outras proteínas de replicação durante o processo de replicação do DNA.