Cloroform deuterat
13.4.4 Evaluarea și menținerea performanțelor instrumentului
Incorporarea instrumentelor de laborator în sistemele de management al calității utilizate pentru certificările de laborator (de exemplu, ISO17025 pentru laboratoarele analitice) necesită evaluarea și menținerea performanțelor instrumentului la intervale regulate. Aceste certificări permit cercetătorului analitic de laborator să creeze teste de calificare a funcționării (OQ) și de calificare a performanței (PQ) în jurul utilizării preconizate a instrumentului. Astfel, pentru RMN, testele OQ/PQ pot varia în funcție de testele analitice comune care urmează să fie efectuate pe instrument. Instrumentele moderne au proceduri automate care necesită ca utilizatorul să introducă proba corespunzătoare, apoi se efectuează o serie de teste în mod automat. La sfârșitul acestor teste, se emite un raport care permite utilizatorului să evalueze performanța generală a spectrometrului.
Pentru testarea proteinelor terapeutice în soluții apoase, aceste teste OQ ar trebui să includă: calibrarea temperaturii, forma liniilor asupra semnalului de acetonă în cloroform deuterat, sensibilitatea asupra semnalelor de etilbenzen în cloroform deuterat și/sau suprimarea apei cu evaluarea sensibilității asupra protonilor anomeri ai unei soluții de zaharoză 2 mM. Calibrarea temperaturii este importantă deoarece dinamica unei proteine este influențată de condițiile ambientale ale soluției, care pot avea efecte mari asupra lățimilor de linie și frecvențelor semnalului observat. Reglarea temperaturii probei în spectrometrele RMN se bazează pe un control atent al temperaturii aerului din sondă și al debitului. Impactul aerului din sondă asupra temperaturii probei poate fi măsurat prin măsurarea deplasărilor chimice ale unei soluții de metanol 100% sau de etilenglicol 100%. Aceste deplasări au fost măsurate cu atenție, astfel încât temperatura reală a probei să poată fi evaluată cu o anumită temperatură a aerului din sondă și o anumită setare a debitului.
Impactul existenței unei bune caletări a probei (adică un câmp magnetic uniform pe partea observată a probei) asupra calității spectrale nu poate fi supraestimat: cu cât vârfurile sunt mai înguste, cu atât rezoluția și sensibilitatea semnalelor ce urmează a fi măsurate sunt mai bune. În mod specific, dacă se utilizează tehnici de suprimare a semnalelor, cu cât baza mai îngustă a vârfului care trebuie suprimat este mai îngustă, cu atât mai bine vor funcționa tehnicile de presaturare sau de suprimare selectivă a semnalelor în bandă îngustă. Din fericire, apariția tehnicilor de cartografiere a câmpului și de ajustare a gradientului a simplificat această sarcină, care necesită adesea mult timp, de ajustare a setărilor de ajustare pentru fiecare probă. Cu toate acestea, vor exista eșantioane pentru care hărțile de shim nu vor funcționa bine și va trebui să se petreacă timp pentru ajustarea shim pentru a obține un răspuns optim al instrumentului.
Evaluarea sensibilității spectrometrului cu eșantioane standard este o modalitate ideală de urmărire a performanțelor sistemului, iar valorile obținute în urma testelor standard trebuie să respecte sau să depășească specificațiile spectrometrului stabilite de producător. De remarcat că specificațiile spectrometrului sunt adesea stabilite de producător într-un mod conservator pentru a se asigura că instrumentul lor trece aceste teste la instalare. Cu toate acestea, efectuarea testelor OQ/PQ la intervale regulate permite proprietarului spectrometrului să se familiarizeze cu capacitățile instrumentului său specific. Abaterile de la setul de valori stabilite prin testele de rutină trebuie examinate cu atenție, deoarece acestea ar putea fi un indiciu al unei funcționări defectuoase a instrumentului.
În cazul analizei moleculelor mici în solvenți organici, utilizarea semnalului de acetonă în cloroform deuterat pentru a obține nu numai o formă de linie lorentziană și o FWHH îngustă, ci și o bază îngustă (de exemplu, <20 Hz la 20% din semnalul de 13C-satelit) conduce, de obicei, la cea mai bună sensibilitate la semnalele de etilbenzen în cloroform deuterat. În cazul spectrometrelor utilizate pentru obținerea de spectre în soluții apoase, o a doua măsurătoare a sensibilității este mai importantă: capacitatea spectrometrului de a obține o sensibilitate și o rezoluție bune din semnalele din apropierea vârfului apei. Astfel, măsurarea sensibilității cu semnalele de protoni anomeri dintr-un etalon alcătuit din zaharoză 2 mM în soluție 95% H2O/5% D2O cu suprimarea apei aplicată este o măsură mai realistă a performanței semnal-zgomot a spectrometrului pentru RMN a probelor terapeutice proteice.
Pentru un PQ pe un spectrometru care evaluează calitatea proteinelor terapeutice, un atribut critic de calitate al acestor medicamente este o structură terțiară specifică conferită de plierea lanțului de aminoacizi. Prin urmare, ca PQ pe un spectrometru care efectuează analiza hărții structurii 2D, spectrele 2D-HSQC pot fi rulate într-o perioadă scurtă de timp pe o probă îmbogățită izotopic cu 15N sau 13C pentru a stabili capacitatea spectrometrului de a efectua programe de impulsuri cu scheme eficiente de decuplare și de selecție a coerenței gradientului. Soluțiile standard de proteine îmbogățite izotopic cu 13C sau 15N (de exemplu, proteine cu domeniu SH3 sau ubiquitină) în tuburi sigilate sunt disponibile în comerț la concentrații care permit colectarea datelor în câteva ore. Spectrometrele calibrate în mod corespunzător la 500 MHz și mai sus și echipate cu o criosonda pot măsura hărți de structură 2D la proteine cu abundență naturală (adică neîmbogățite izotopic) la o concentrație de ∼1,0 mM în 2-3 zile de spectrometru .
.