PMC
DISCUSSION
Sistemul model de sintezom ADN conține toate proteinele necesare pentru a susține fiecare fază a procesului de replicare a ADN, iar aceste proteine au dimensiuni cuprinse între 20 și 240 kDa în condițiile actuale de testare și pot realiza toate fazele procesului de replicare a ADN in vitro. În acest studiu, activitatea de ADN primază asociată sintezomului a fost caracterizată prin examinarea sintezei și extinderii primerilor de ARN catalizați in vitro de către sintezomul ADN. Rezultatele analizelor noastre funcționale arată că activitatea de ADN-primază asociată sintezomului în fracția P4 derivată din celulele canceroase mamare este de 30 de ori mai mare decât cea a extractelor brute de celule canceroase mamare. Fracția P4, care conține sintezomul ADN, a fost obținută din fracțiile combinate de proteine solubile nucleare și citoplasmatice preparate din celulele MCF7 și a fost utilizată pentru a efectua testul de replicare a ADN-ului SV40 in vitro. Activitățile ADN-polimerazei α și δ și ale ADN-primazei din fracția P4 sunt de 20-40 de ori mai mari decât cele ale extractelor celulare brute ; ceea ce face din aceasta un instrument util pentru aceste studii, deoarece este pe deplin competentă pentru a susține sinteza și extinderea primerilor de ARN într-un sistem model in vitro care s-a demonstrat că susține toate fazele procesului de replicare a ADN .
ADN-primaza prezintă o procesivitate unică în sinteza și extinderea primerilor de ARN. Această procesivitate este definită de o competiție între adăugarea următoarei nucleotide corecte și disocierea complexului primer-template . ADN-primaza este singura enzimă capabilă să sintetizeze primeri ARN în timpul inițierii sintezei ADN . Niciuna dintre subunitățile unice de primază nu este capabilă să sintetizeze sau să extindă singură un primer de ARN . Sintezomul conține ambele subunități de primază (adică p49 și p58) și poate cataliza sinteza de primeri de ARN in vitro folosind un șablon de poli(dT) exogen. Sintezomul sintetizează un primer de ARN funcțional de lungime unitară (7-10 nt). Acești amorse de ARN sunt complet hidrolizați de RNază în fragmente scurte de 1-4 bp, dar nu sunt hidrolizați de DNază. Trăsătura caracteristică a primazei asociate sintezei, care o deosebește de o primază ADN izolată, este capacitatea sa specifică de a extinde amorța ARN pentru a forma un lanț de ADN-amorță. Sinteza unui șir de ADN-amorsă necesită, de asemenea, o activitate de ADN-polimerază în plus față de activitatea de ADN-primază. În mod normal, activitatea ADN-polimerazei este comutată pentru a începe alungirea unui primer de ARN după sinteza primerului. Numai amorsele de ARN cu o lungime ≥7 nucleotide sunt utilizate de către polimerază; indiferent de concentrația de dNTP . Astfel, sinteza și prelungirea amorselor de ARN de lungime unitară nu necesită doar o primază, ci implică, de asemenea, subunitatea p180 a ADN polimerazei α , iar sintezomul conține ADN polimeraze foarte active, care catalizează încorporarea dezoxiribonucleotide pentru a prelungi amorsa de ARN. Amorsele de ARN sunt extinse de către polimerazele asociate sintezomului pornind de la un oligoprimer ADN-ARN cu o lungime de 20-40 nt (amorța de ADN). Șirurile de ADN-primeri conțin două componente: (1) o ribonucleotidă de 10 nt și, (2) o dezoxiribonucleotidă de 20-40 nt. RNaza și DNaza hidrolizează separat componentele corespunzătoare ale șirurilor de ADN-amorț, rezultând o scurtare, dar o hidroliză incompletă a șirului de ADN-amorț.
O altă caracteristică a sintezomului este sinteza rapidă și dimensiunile distincte ale amorselor de ARN și ale șirului de ADN-amorț. Sintezomul catalizează rapid sinteza atât a unui amorsă de ARN, cât și a unei catene de ADN-amorsă, iar nivelurile de echilibru par să se acumuleze în termen de (5-15 min). Mărimile amorselor de ARN de lungime unitară (7-10 nt) și ale șirului de ADN-amorsă (20-40 nt) catalizate de sintezomul de ADN rămân întotdeauna constante, indiferent de concentrația sintezomului sau de timpul de reacție. Acest studiu privind mecanismul activității ADN-primazei implică faptul că sinteza primilor de ARN, catalizată de primaza asociată sintezomului, are loc printr-o inițiere lentă, o polimerizare rapidă și o terminare „inteligentă” a amorsei . ADN-primaza se leagă de șablonul ADN și inițiază lent sinteza unei dinucleotide. După sinteza dinucleotidului, NTP-uri suplimentare sunt adăugate rapid la dinucleotidul polimerizat de ADN primază. Activitatea ADN-primazei se caracterizează prin sinteza fiecărui primer ARN într-o singură „explozie” de activitate, mai degrabă decât prin sinteză distributivă . Odată ce au fost generați amorse de lungime unitară de 7-10 nt, placa de primază acționează ca un semnal de terminare și inhibă continuarea sintezei de ARN. Această inhibiție se datorează generării unui prim-template stabil, care probabil rămâne asociat cu complexul pol α-primază. Este interesant faptul că șirurile de ADN-amorsă sintetizate in vitro de către sintezomul ADN sunt similare cu amorsele de ARN sintetizate in vitro, catalizate de sintezom. Sinteza unui lanț de ADN-amorț atinge rapid niveluri de echilibru, iar dimensiunea lanțului de ADN-amorț rămâne relativ constantă (între 20 și 40 nt), indiferent de timpul de reacție sau de concentrația sintezomului utilizat în timpul reacției de sinteză. Sinteza catenei de ADN-amorsă necesită activitatea ADN polimerazei α, pe lângă ADN-primaza . Rezultatele noastre sugerează că activitatea polimerazei α asociată sintezomului se caracterizează, de asemenea, printr-o polimerizare rapidă și o terminare „inteligentă” în sinteza șuviței de ADN-primer. Sintezomul, cu caracteristica de polimerizare rapidă și de terminare inteligentă a catenei de ADN-amorsă, diferă de sinteza mediată de fragmentul Klenow al ADN polimerazei I din E. coli în timpul extensiei amorsei ARN. Spre deosebire de sintezom, extensia amorselor de ARN catalizată de polimeraza I depinde puternic de durata timpului de reacție. Creșterea timpului de reacție sporește semnificativ cantitatea și dimensiunea amorsele de ARN extinse.
Au fost propuse două mecanisme potențiale pentru a explica trecerea de la sinteza amorsei la extinderea amorsei în timpul procesului de replicare a ADN-ului . Primul propune că complexul amorsă-polimerază se disociază de amorsă-placă și se reasociază cu situsul activ al polimerazei. Cea de-a doua propune că schimbarea are loc în cadrul unei translocații intrastrand a complexului pol α-primază de la situsul activ al primazei la situsul activ al polimerazei α. Această schimbare nu implică disocierea complexului pol α-primază de la șablonul ADN. Experimentele noastre demonstrează că prelungirea amorsei ARN catalizată de polimeraza I este inhibată de concentrații mari de sintezom ADN. Capacitatea fragmentului Klenow de a prelungi un amorsă de ARN depinde de sinteza amorselor de ARN catalizată de sintezom, care are nevoie, de asemenea, de un situs de legare disponibil la terminația amorsă de ARN. Prin urmare, fragmentul Klenow al polimerazei I din E. coli necesită disocierea complexului primază-polimerază de la placa de amorsă. Cu toate acestea, concentrații mari de sintezom concurează cu polimeraza I pentru locul de legare de pe placa de amorsare, astfel încât extinderea amorselor de ARN este inhibată. Sintezomul formează un complex fără ieșire la capătul terminal al primerului de ARN, ceea ce duce la incapacitatea fragmentului Klenow de a participa la procesul de extindere a primerului de ARN. Acest rezultat sugerează că complexul polimerază-primază al sintezomului de ADN trebuie să se disocieze de placa de amorsare după sinteza amorsului de ARN. Rezultatul nostru arată că sintezomul crește dimensiunea amorsei de ARN de lungime unitară atunci când temperatura de reacție este redusă. Scăderea temperaturii de reacție crește eficiența de comutare a complexului polimerază-primază și scade denaturarea primer-placă . În plus, subunitatea p49 a ADN-primazei conține activitatea catalitică a ARN-polimerazei, necesară pentru a crește dimensiunea amorsei ARN de lungime unitară . Prin urmare, rezultatele noastre sugerează că ADN-sintezomul are activitatea adecvată de ARN-polimerază necesară pentru a forma fragmente de ADN amorse de ARN.
Analiza cinetică a inițierii și alungării amorsei de ARN demonstrează că ADN-primaza asociată sintezomului este o enzimă lentă și relativ slabă în ceea ce privește legarea șablonului . ADN-primaza este, de asemenea, o polimerază a acidului nucleic predispusă la erori, deoarece această enzimă are o capacitate foarte slabă de discriminare a nucleotidelor; ceea ce duce la încorporarea greșită a nucleotidelor . Prin urmare, analiza noastră a cineticii enzimatice a activității ADN-primazei asociate sintezomului ar putea fi utilizată pentru a determina relația dintre ratele de sinteză și frecvența erorilor în timpul sintezei primerilor ARN. Sinteza discontinuă a fragmentelor de ADN (Okazaki) pe filamentul întârziat al furcii de replicare este un proces biochimic important în timpul replicării ADN. Pentru a asigura o coordonare eficientă între sinteza continuă de ADN pe filamentul conducător și sinteza discontinuă de ADN pe filamentul întârziat, ADN-primaza are nevoie de o serie de etape enzimatice precis cronometrate care să controleze sinteza amorselor de ARN. Un studiu cinetic al unui complex de replicare multiproteic din bacteriofagul T7 arată că primaza acționează ca o frână moleculară și oprește tranzitoriu progresia furcii de replicare . Datorită interacțiunii fizice a ADN polimerazei δ cu pol α, rezultatul prezentat de Lee et al. sugerează că ADN-primaza poate fi capabilă să împiedice sinteza șirului conducător să depășească sinteza șirului întârziat în timpul etapelor enzimatice lente de pe șirul întârziat.
Diverse modele de replicare a ADN-ului eucariot au fost utilizate în studiul funcției ADN-primazei. Sistemul de replicare a matricei nucleare de lizat de celule întregi a fost utilizat pentru a examina sinteza și distribuția primerului ARN nativ și a ADN-ului nazal amorsat cu ARN în nucleele celulelor eucariote folosind șablonul ADN bicatenar endogen legat de matricea nucleară . Amorsele de ARN sunt strâns asociate cu matricea nucleară a celulelor de mamifere care proliferează rapid . Amorsele de ARN sunt atașate în mod covalent la ADN-ul nou replicat pentru a forma ADN-ul nazal amorsat cu ARN. ADN-ul amorsat cu ARN este degradat în câteva oligoribonucleotide cu o lungime de ~10 nt după digestia cu DNază , iar cel puțin 94% din amorsele de ARN nativ și ADN-ul nazal amorsat cu ARN sunt localizate în fracțiunea de matrice insolubilă a nucleului. Amorsele de ARN cu o lungime de 8-10 nt care se găsesc asociate cu matricea nucleară, reprezintă <1% din ARN-ul total din celulă ; ceea ce face foarte dificilă examinarea amorsei de ARN și a ADN-ului nazal amorsat cu ARN în fracțiunea de matrice nucleară a celulei din cauza unei concentrații foarte scăzute de amorse de ARN și a cantității relativ mari de alte ARN-uri. Mai mult decât atât, izolarea primerilor de ARN și a ADN-ului nazal amorsat cu ARN din lizații de celule întregi cu marcare cu radio-nucleotide este o procedură de purificare complicată și deloc trivială atunci când este aplicată la analiza sintezei primerilor de ARN mediate de modelul de replicare a matricei nucleare. În schimb, sintezomul de ADN purificat din fracțiile nucleare și citoplasmatice combinate conține ADN-primază și ADN-polimeraze foarte active și susține pe deplin sinteza de amorse de ARN nativ in vitro folosind un șablon de ADN dublu catenar care conține originea SV40. Amorsele de ARN sintetizate de sinteza ADN sunt de lungime normală (10-20 nucleotide) și par să funcționeze corespunzător pentru a susține extensia amorselor de către ADN polimeraza. Acești amorse de ARN pot fi extinse cu ușurință pentru a forma un ADN nașcent de 100-200 nt, amorsat cu ARN. Sinteza discontinuă a fragmentelor de ADN (Okazaki) pe filamentul întârziat al furcii de replicare este un proces biochimic important implicat în replicarea ADN-ului, iar fragmentele de ADN (Okazaki) de lungime completă, amorsate cu ARN, sintetizate de sintezomul ADN au, de asemenea, o lungime de aproximativ 100-200 nucleotide. Am observat că sintezomul ADN ar putea sintetiza diferiți produși de ARN amorsat cu dimensiuni cuprinse între 10 și 200 nt în lungime. Acest lucru poate fi considerat rezonabil, deoarece amorsele de ARN nativ și ADN-ul nazal amorsat cu ARN sunt, de asemenea, de această lungime aproximativă. Observația de mai sus, conform căreia sinteza amorsei de ARN și a ADN-ului nazal amorsat de ARN, catalizată de sintezomul ADN, este în esență echivalentă cu cea din studiul publicat folosind modelul de replicare a matricei nucleare de lizat celular integral , sugerează că sintezomul ADN este un sistem model excelent capabil să realizeze un proces de replicare a ADN-ului semnificativ din punct de vedere fiziologic in vitro.
Modelul sintezomului ADN este, prin urmare, un instrument unic și valoros în studiul funcției ADN-primazei. Sinteza și alungirea amorselor de ARN, mediată de primază, realizată de sintezomul ADN seamănă foarte mult cu cea realizată de alte modele de replicare fără celule. Modelul sintezomului susține sinteza și prelungirea amorse de ARN in vitro folosind șabloane de ADN monocatenar exogene, precum și ADN bicatenar supraînfășurat care conține o origine de replicare SV40 intactă. Prin urmare, sintezomul ADN este pe deplin capabil să medieze sinteza și extinderea amorse de ARN in vitro și poate facilita investigarea în continuare a mecanismelor care inițiază sinteza ADN în celulele eucariote. Împreună, rezultatele noastre sugerează că modelul sintezomului oferă un instrument unic pentru studierea interacțiunii dintre ADN primază și alte proteine de replicare în timpul procesului de replicare a ADN.
.