The genetic variation of different developmental stages of Schistosoma japonicum: do the distribution in snails and pairing preference benefit the transmission?
Colectarea probelor
Colectarea probelor și designul experimental sunt rezumate în Fig. 1. Etapele de colectare a probelor sunt prezentate mai jos, inclusiv colectarea melcilor, colectarea cercarilor, infectarea șoarecilor și colectarea viermilor adulți, precum și colectarea miracidelor.
Flowchart of sample collection and experimental design
Colectarea melcilor
Cele de melci Oncomelania hupensis au fost colectate în martie și septembrie 2016 din zona estică a lacului Dongting (29° 32′ 5.25″ N, 112° 52′ 35.00″ E), provincia Hunan, China. Melcii au fost localizați în șanțuri din 3 sate la o distanță de 10 km. Locul de colectare este o zonă mlăștinoasă și nu un parc național sau o altă zonă protejată sau un teren privat. Colectarea a fost efectuată cu permisiunea și asistența Institutului de control al schistosomiei din provincia Hunan, China, care supraveghează controlul melcilor în zonă. Oncomelania hupensis nu este o specie pe cale de dispariție sau protejată. Melcii au fost aduși înapoi în laborator și clasificați în grupa A pentru cei colectați în martie și în grupa B pentru cei colectați în septembrie. După o lună de captivitate, melcii au fost spălați și transferați în flacoane individuale umplute cu apă timp de 3 ore la lumină la 25 °C, pentru a stimula apariția cercariei în vederea identificării infecției cu S. japonicum. În cele din urmă, 20 de melci din grupul A și 25 de melci din grupul B au fost identificați ca fiind infectați cu S. japonicum.
Colectarea cercariei
După ce cercarii au fost eliberați din melci individuali, unii au fost transferați într-o farfurie cu ajutorul unei bucle și spălați în soluție de spălare a cercariei (5 g/l hidrolizat de lactalbumină, 6,8 g/l NaCl, 0,4 g/l KCL, 0,2 g/l CaCl2, 0,2 g/l MgSO4-7H2O și 1 g/l glucoză) sub microscopie. După 3 spălări, cercarii au fost pipetați individual cu 2 μl de soluție de spălare sterilizată pe un card Whatman™ FTA (GE Healthcare, Pittsburgh, SUA). După uscare, cardurile au fost depozitate într-o pungă de plastic sigilată într-un desicator la temperatura camerei. Cel puțin 50 de cercarii per melc au fost colectate individual și stocate pe carduri Whatman™ FTA.
Infectarea șoarecilor cu cercariae de la melcul individual
Pentru a distinge melcii infectați cu S. japonicum de un singur sex, 2 șoareci Kunming de laborator au fost infectați percutanat cu 30 de cercariae de la fiecare melc per șoarece. În total, 40 de șoareci au fost infectați pentru 20 de melci din grupul A și 50 de șoareci au fost infectați pentru 25 de melci din grupul B. Viermii au fost preluați din venele mezenterice ale fiecărui șoarece prin perfuzie cu NaCl 0,9% și disecție 7 săptămâni mai târziu după infectare. S-a avut grijă să se reducă la minimum potențialul de scindare a viermilor adulți împerecheați, cauzat de forța mecanică în timpul perfuziei și disecției, folosind 3 tehnicieni cu experiență pentru a procesa viermii cât mai repede posibil. Fiecare pereche de viermi a fost transferată în tuburi separate pentru a fi spălată și marcată imediat și a fost depozitată în etanol absolut în perechi după ce s-a produs separarea spontană. Viermii nepereche de la fiecare șoarece au fost verificați la microscop pentru a confirma sexul și apoi au fost depozitați în etanol.
Infectarea șoarecilor cu cercariae grupate de la toți melcii (metoda I și II) și colectarea viermilor adulți
Pentru infecțiile ulterioare, 17 din cei 20 de melci din grupul A și 16 din cei 25 din grupul B au rămas în viață și capabili să producă suficiente cercariae. Pentru cele două grupuri de melci au fost utilizate două metode diferite de punere în comun a cercarilor. În cazul celor 17 melci rămași din grupul A, toți melcii au fost puși împreună într-un balon cu apă pentru a stimula apariția cercariei (metoda I). Treizeci și unu de șoareci au fost apoi infectați percutanat cu 34 de cercariae pentru fiecare șoarece. Pentru infecția cu 16 melci din grupul B, 2 cercarii de la fiecare melc cu excreție individuală au fost adunate împreună, iar cele 32 de cercarii amestecate au fost folosite pentru a infecta un șoarece (metoda II), replicându-se pentru a infecta 22 de șoareci în total. Toți șoarecii au fost sacrificați pentru a colecta viermii S. japonicum la 7 săptămâni după infectare, așa cum s-a descris mai sus. În cele din urmă, au fost colectați 530 de viermi de la șoareci prin metoda I (Grupul A), 484 de viermi de la șoareci prin metoda II (Grupul B).
Colectarea miracidelor
Înainte ca toți șoarecii infectați să fie sacrificați pentru a colecta viermii adulți, au fost colectate fecale de la fiecare șoarece timp de 7 zile, pentru a concentra ouăle excretate prin intestin pentru eclozarea miracidelor. Sedimentul de ouă de la fiecare șoarece a fost expus la apă declorurată într-un balon la lumină, la 25 °C, pentru a ecloda miracidia. Miracizii au fost recoltați din apa superioară a fiecărui balon cu o pipetă și au fost transferați într-o farfurie cu soluție de spălare a miracizilor (5 g/l de hidrolizat de lactoalbumină, 6,5 g/l de NaCl, 0,14 g/l de KCl, 0,12 g/l de CaCl2 și 0,20 g/l de NaHCO3). După 3 spălări, miracidia a fost pipetată individual cu 2 μl de soluție de spălare sterilizată pe un card Whatman™ FTA. După ce a fost uscat, cardul a fost depozitat într-o pungă de plastic sigilată într-un desicator la temperatura camerei. S-au colectat cel puțin 50 de miracidii per scaun de șoarece.
Miracidii eclozionați din ouăle prinse în ficatul șoarecilor infectați au fost, de asemenea, colectați după cum urmează. Ficatul fiecărui șoarece infectat a fost colectat după colectarea viermilor adulți, omogenizat în 1,2% NaCl rece și filtrat pentru a obține sedimentul de ouă. Miracizii au fost eclozionați prin aceeași metodă ca cea utilizată pentru proba de scaun. În cele din urmă, cel puțin 50 de miracidii per ficat de șoarece au fost pipetați individual și depozitați pe carduri Whatman™ FTA.
Extragerea ADN-ului genomic
Pentru ADN-ul unei singure probe de cercarii sau miracidii, un disc cu diametrul de 2 mm a fost îndepărtat din centrul fiecărei zone de pipetare a probei de pe un card Whatman™ FTA cu ajutorul unui Harris Micro-punch de 2 mm (GE Healthcare Life Sciences, Stevenage, UK). Discul a fost plasat în baza unei plăci cu 96 de godeuri, cu fundul în U de 1,2 ml. După o spălare cu 100 μl de reactiv de purificare FTA (GE Healthcare Life Sciences) timp de 5 minute, urmată de 100 μl de tampon TE (10 mM Tris-Cl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0), în fiecare gode s-au adăugat 14 µ de NaOH 0,1 M cu 0,3 mM EDTA, pH 13,0, iar soluția a fost lăsată la incubat timp de 5 minute, după care s-au adăugat 26 µl de tampon Tris-HCl 0,1 M, pH 7,0. Apoi, placa a fost amestecată cu ajutorul unui mixer vortex de 3 ori timp de aproximativ 10 secunde fiecare. Soluția a fost apoi lăsată la temperatura camerei timp de 10 min, a fost vortexată prin impulsuri de 10 ori, iar eluatul a fost transferat într-o placă curată cu 96 de godeuri și a fost depozitat la – 20 °C pentru utilizare ulterioară.
În ceea ce privește viermii adulți individuali, partea anterioară, inclusiv uterul, a fost tăiată la microscop de la fiecare vierme femelă adultă pentru a evita influența ouălor din uter asupra genotipului viermelui femelă. În timp ce viermii masculi întregi sau femelele imature au fost utilizați pentru extragerea ADN-ului. ADN genomic total a fost extras individual de la fiecare vierme folosind o procedură standard de dodecil sulfat de sodiu-proteinază K, după cum urmează. Fiecare vierme a fost incubat și decongelat în 400 μl de tampon de extracție care conține 50 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1% SDS și 100 mg/ml de proteinază K, la 56 °C timp de 1 oră, cu amestecare ușoară. ADN-ul din soluție a fost extras prin purificare standard cu fenol/cloroformă, urmată de acetat de sodiu 3 M (pH 5,2) și precipitare cu etanol. Peletele de ADN au fost spălate în etanol 70%, uscate la aer și resuspendate în 20 μl de TE (pH 8,0), depozitate la – 20 °C ca extract brut de ADN de vierme adult pentru utilizare ulterioară.
Amplificarea prin PCR și genotiparea microsateliților
Pentru a confirma existența ADN genomic în eluția cartelei FTA sau în extractul brut din proba depozitată în etanol, fragmentul de ADN ribosomal 28S a fost amplificat din soluția de ADN a unei singure cercarii, miracidium sau vierme adult, folosind următorii amorsere: înainte (5′-GTG GAG TTG AAC TGC AAG C-3′) și invers (5′-GCT CAA CAA CAW TAA TAG TCA AAC CTG-3′). PCR-urile au fost efectuate cu ajutorul Illustra PuReTaq Ready-To-Go-PCR Beads într-o placă cu 96 de godeuri (GE Healthcare Life Sciences, SUA). Pentru fiecare perlă, s-au adăugat 2 µl de eluzie FTA de la o singură larvă sau 0,5 µl de extract brut de la un singur vierme, cu 1 µl din fiecare primer și apă până la un volum final de 25 µl. Amplificarea a fost implementată cu următorul program: 95 °C timp de 5 minute; urmat de 40 de cicluri de 30 s la 95 °C, 30 s la 60 °C și 40 s la 72 °C; și o etapă finală de extensie la 72 °C timp de 7 minute. Reacțiile au fost apoi verificate prin rularea a 5 µl pe un gel TAE de agaroză 2%.
S-a efectuat o genotipare la scară mică pentru 30 de cercariae, 30 de miracidia și 30 de viermi care au fost aleși la întâmplare, pentru a construi un panel optim de loci microsateliți multiplex pentru amplificarea PCR. Au fost verificați 20 de loci dezvoltați și validați în studii anterioare și din laboratorul nostru. În cele din urmă, au fost selectați 9 loci microsateliți (fișier suplimentar 1: tabelul S1) pentru a forma panoul. Loci microsateliți pentru fiecare probă de ADN au fost genotipate cu ajutorul kitului Type-it Microsatellite PCR (Qiagen, Manchester, Regatul Unit) cu multiplexul de 9 loci. Primerul forward al fiecărei perechi a fost marcat cu un colorant fluorescent adecvat, inclusiv 6-FAM, HEX, TAMRA și ROX (Fișier suplimentar 1: Tabelul S1). Reacțiile PCR au fost pregătite într-o placă PCR cu 96 de godeuri, utilizând 6,25 μl de 2× master mix, 1,25 μl de soluție Q, 0,5 μl de primeri (10 μM), 2 μl de șablon de ADN și 2,5 μl de ddH2O, apoi au fost efectuate într-un termociclator Bio-Rad cu următorul program: 95 °C timp de 5 minute; urmat de 35 de cicluri de 30 de secunde la 95 °C, 90 de secunde la 60 °C și 3 minute la 72 °C; urmat de o etapă finală de extensie la 60 °C timp de 45 de minute. Reacțiile PCR au fost verificate prin trecerea a 5 µl pe un gel de agaroză TAE 2%, iar amplificările reușite au fost trimise la Sangon Biotech (Shanghai, China) pentru analiza fragmentelor pe un analizor genetic ABI3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA, SUA). Genotipurile au fost marcate cu ajutorul unui plugin de microsateliți din Geneious 11.0 . Toate probele au fost amplificate și genotipate de două ori pentru a reduce deviația. În total, au fost generate genotipurile a 346 de cercariae, 701 viermi adulți și 393 de miracidia pentru următoarele analize.
Analize de diversitate genetică
Diversitatea genetică a fiecărui locus a fost estimată în toate cercariae genotipate prin calcularea numărului observat de alele (Na), a numărului efectiv de alele (Ae) în GenAlEx 6.5 și a bogăției alelice (Ar) și a diversității genice (Hs) în hierfstat ver. 0.04-22 , incluzând 156 de cercarii de la 20 de melci din grupul A și 190 de cercarii de la 25 de melci din grupul B. Abaterea de la echilibrul Hardy-Weinberg (HWE) pentru fiecare locus a fost testată cu testul Chi-pătrat în GenAlEx, iar testul de dezechilibru de legătură între loci a fost calculat în SHEsis .
Na, Ae, Ar și Hs au fost calculate pentru diferite populații în timpul procesului de infectare a șoarecilor, după cum urmează. Pentru populațiile de cercari utilizate în infecție, au fost evaluate 132 de cercari de la 17 melci din grupul A (utilizate în metoda I) și 122 de cercari de la 16 melci din grupul B (utilizate în metoda II). După genotiparea și filtrarea datelor de calitate scăzută, au fost genotipate cu succes cel puțin 5 perechi de viermi adulți (atunci când erau prezenți) și toți viermii nepereche de la fiecare șoarece. În total, au fost implicați 357 de viermi de la șoareci în metoda I (utilizând cercariae de la 17 melci amestecați din grupul A), 344 de viermi de la șoareci în metoda II (utilizând cercariae amestecate în mod egal de la 16 melci individuali din grupul B). În plus, diversitatea genetică a viermilor adulți din fiecare șoarece a fost estimată pentru a verifica consistența alelică a viermilor adulți în rândul șoarecilor din Metoda I și II separat. În ceea ce privește populațiile de miracidium, diversitatea genetică a miracidelor din ficat și scaun a fost calculată la nivel suprapopulațional (miracidelor din ficatul sau scaunul tuturor șoarecilor), din cauza faptului că au fost genotipate doar 3-4 miracidii din ficat sau scaun la fiecare șoarece, inclusiv 93 de miracidii din ficat (3 pe șoarece) și 124 de miracidii din scaun (4 pe șoarece) în metoda I și 88 de miracidii din ficat și scaun (4 pe șoarece separat) în metoda II.
Analysis of molecular variance (AMOVA)
Diferențierea genetică a tuturor cercarilor genotipate din Grupul A și Grupul B a fost estimată cu ajutorul AMOVA în Arlequin ver. 3.5.2.2 . După excluderea melcilor care nu au fost utilizați pentru infecții cu șoareci, a fost testată diferențierea între 132 de cercarii de la 17 melci din Grupul A (pentru Metoda I) și 122 de cercarii de la 16 melci din Grupul B (pentru Metoda II). După infectare, a fost testată diferențierea dintre cei 357 de viermi adulți din metoda I și populația inițială de cercari (132 de cercariae din grupul A). De asemenea, cei 344 de viermi din Metoda II au fost testați față de cei 122 de cercarii din grupul B. În plus, a fost evaluată separat variația viermilor adulți în rândul a 31 de șoareci din Metoda I și a viermilor adulți în rândul a 22 de șoareci din Metoda II. În ceea ce privește miracidia, s-a testat diferențierea genetică între 93 de miracidia din ficat și 124 de miracidia din fecale în Metoda I și același lucru pentru 88 de miracidia atât din ficat, cât și din fecale în Metoda II.
Analiză de înrudire pentru singletoni de cercariae cu niMLGs
S-a numărat numărul de genotipuri de cercariae de la fiecare melc. Deoarece este dificil de distins erorile de tipărire sau mutațiile somatice în timpul înmulțirii sporocistului de genotipul original al miracidiumului, un grup de genotipuri de cercariae cu mai puțin de 2 alele nepotrivite au fost identificate ca niMLG-uri și atribuite unui neam derivat din același miracidium din fiecare melc. În cele din urmă, numărul de miracidii care au stabilit clone genetice în fiecare melc a fost evaluat pe baza numărului de linii de descendență cu ajutorul pachetului R allelematch ver. 2.5 .
Potrivit faptului că se presupune că cercarii cu niMLG-uri într-un melc au derivat dintr-un singur miracidium , unul dintre genotipurile (singleton) pentru niMLG-uri a fost atribuit pentru a reprezenta un grup de cercarii care au provenit dintr-un miracidium cu ajutorul funcției amCluster din allelematch, pentru a produce setul de date filtrat pentru analiza rudeniei între miracidii. Apoi, rudenia între singletoni (miracidia) a fost estimată cu ajutorul coeficientului de corelație a mărimii alelelor (I′) conform Streiff în SPAGeDi ver. 1.5a la nivel intrascaracatiță și interscaracatiță pentru 20 de melci din grupul A și 25 de melci din grupul B, pentru a afla dacă agregarea miracidelor într-un melc se corela cu similitudinea genetică a miracidelor.
Distribuția alelelor pentru subseturile de cercarii de la numărul diferit de melci
Distribuția genetică neuniformă a cercariei între melci implică faptul că dimensiunea eșantionului de melci-gazdă ar afecta distribuția alelelor din suprapopulația de cercarii (cercarii de la toți melcii). Na, indicele de bază pentru indicarea abundenței genetice a unei populații , a fost evaluat în continuare pentru fiecare locus în diferite subgrupuri de cercariae prin selectarea la întâmplare a unor numere diferite de melci. Melcii au fost selectați în mod aleatoriu la fiecare număr dat de melci, care a fost stabilit de la 1 la maxim în fiecare grup folosind funcția de bază sample din R, cu 100 de replici. În cadrul fiecărei replici, numărul de cercarii din fiecare melc a fost stabilit la 5, care a fost determinat în funcție de fezabilitatea practică și de numărul mediu de cercarii genotipate în fiecare melc în acest studiu. Genotipurile de cercariae pentru același număr de melci au fost fuzionate, iar Na a fost apoi estimat pentru fiecare locus cu ajutorul funcției nb.alleles din pachetul R hierfstat. Relativitatea dintre diversitatea genetică și numărul de melci a fost evaluată prin calcularea celei mai mici dimensiuni a eșantionului de melci atunci când au fost stabilite 50% și 95% din Na total.
Distanța genetică dintre viermii adulți femele și masculi
Pentru a detecta o potențială preferință genetică pentru S. japonicum în timpul împerecherii, distanța genetică interindividuală Dsw între masculul și femela fiecărei perechi la șoareci individuali a fost măsurată cu Populations ver. 1.3.32 (http://www.bioinformatics.org/~tryphon/populations/), și comparată cu cea dintre femela pereche și viermii nepereche (dacă este disponibilă, nepereche este în cea mai mare parte masculină) în aceeași gazdă.
Identificarea paternității pentru miracidii
Frecvențele alelelor tuturor viermilor adulți și miracidii din fiecare șoarece au fost analizate și calculate cu ajutorul funcției Allele Frequency Analysis din Cervus 3.0 . Toți cei 9 loci au fost în cele din urmă evaluați ca markeri adecvați pentru o analiză ulterioară a filiației, cu o probabilitate combinată de neexcludere mai mică de 0,01 %. Funcția „Simulation of Parentage Analysis” a fost aplicată pe baza frecvenței alelelor, pentru a estima puterea de rezolvare a lociilor codominanți și valorile critice ale loglikelihood (LOD), cu ipotezele următoare: 10 000 de descendenți (miracidia) pentru fiecare șoarece în parte; 10 mame și tați candidați la fiecare șoarece (dimensiunea estimată a eșantionului în funcție de numărul de viermi adulți colectați într-o gazdă); proporția de candidați a fost stabilită la 100 % din viermii adulți genotipați; celelalte opțiuni au fost setate în mod implicit. În cele din urmă, ambele ieșiri din Analiza frecvenței alelelor și Simularea analizei paternității au fost menționate în modulul Analiza paternității, pentru a atribui fiecare descendent părinților săi cei mai probabili. Părinții care au mai mult de 2 alele nepotrivite cu descendenții au fost excluși, iar cei care au avut cel mai mare LOD au fost considerați ca fiind cei mai probabili părinți.
Analiză statistică
Toate datele utilizate în analiza statistică în acest studiu sunt date continue. Semnificația diferenței privind indicii de diversitate genetică (Na, Ae, Ar și Hs) a lociilor, coeficientul de rudenie (I′) și distanța genetică interindividuală (Dsw) între două grupuri au fost evaluate cu un nivel de semnificație de 0,05. În primul rând, distribuția normală a seturilor de date a fost verificată cu testul Sharpiro-Wilk. Apoi a fost aplicat testul t cu eșantioane perechi/independent atunci când seturile de date au respectat distribuția normală. În caz contrar, s-a aplicat testul Wilcoxon signed-rank și testul Mann-Whitney U pentru eșantioanele înrudite/independente. Corecția Bonferroni a fost utilizată pentru a corecta valoarea P în cazul comparațiilor multiple.
.