Toxigene Vibrio cholerae evolutie en vestiging van reservoirs in aquatische ecosystemen
Resultaten
Vier departementen – Artibonite, Centre, Nord-Ouest, en Ouest – zijn verantwoordelijk voor 90% van de gerapporteerde choleragevallen in Haïti (9). We concentreerden onze inspanningen op het departement Ouest (Fig. 1A), een kuststreek rijk aan aquatische ecosystemen waar we toxigene V. cholerae O1 geïsoleerd hebben uit vaste rivier- en estuariene sites (Fig. 1A). De prevalentie van toxigene aquatische V. cholerae O1 correleerde met verhoogde temperatuur en neerslag maar niet met fecale coliformen, wat suggereert dat de aanwezigheid niet alleen te wijten was aan fecale contaminatie (10). Het maandelijkse aantal gevallen in Ouest, dat jaarlijks schommelde maar afnam tijdens het droge seizoen en toenam tijdens het regenseizoen (april tot oktober), correleerde met verhoogde temperatuur en regenval (Fig. 1B). Dit komt overeen met patronen van endemische V. cholerae O1 in Bangladesh en Peru, waar seizoensgebonden cholera-uitbraken correleren met verhoogde V. cholerae O1 in de omgeving en stijgingen in watertemperatuur of regenval (11, 12).
Om een onderscheid te maken tussen evolutie onder selectieve druk (adaptatie) of genetische drift, berekenden we de nonsynonieme (dN) en synonieme substitutie (dS) ratio (dN/dS) (SI Appendix, Fig. S6 en Tabel S5). De evolutionaire dynamiek van de klinische isolaten werd voornamelijk gedreven door zuiverende selectie (dN/dS = 0,6, P < 0,001), consistent met een negatieve Tajima’s D (-2,3, P < 0,005) en een populatie die bottlenecks en/of selectieve sweeps ondergaat. Er wordt verwacht dat negatieve selectie de reeds gevestigde epidemie bij de mens aandrijft die een piek in het adaptieve landschap heeft bereikt tijdens een vroege epidemische fase, aangedreven door diversifiërende selectie (14). In tegenstelling hiermee vertoonden omgevingsisolaten hogere nonsynonieme percentages (dN/dS = 2.1, P < 0.001), kenmerkend voor een heterogene microbiële populatie die recent in een nieuwe omgeving is geïntroduceerd en die fixatie ondergaat van nieuwe variant-gedreven diversifiërende selectie. In feite vonden we omgevingsspecifieke moleculaire afdrukken in de genomen van V. cholerae die succesvol repliceerden en standhielden in het aquatisch milieu. In totaal zeven niet-synonieme mutaties in coderende regio’s, die mogelijk een selectief voordeel toekenden aan de milieupopulatie van V. cholerae, doken op langs de ruggengraat van de fylogenie van milieu-isolaten tussen 2012 en 2015 (Fig. 3 en SI Appendix, Tabel S7). Drie omgevingsspecifieke mutaties, twee vroeg in de bifurcatie van de ruggengraat (Fig. 3) en één in een interne tak (SI Appendix, Tabel S7), beïnvloedden genen in het type II secretiesysteem (TSSII): algemene secretiepathway-eiwitten A en G, en K (SI Appendix, Tabel S7). TSSII speelt een cruciale rol bij de virulentie en overleving van V. cholerae in verschillende niches, zoals aquatische reservoirs of menselijke gastheren (26). Andere mutaties die gevonden werden langs de interne takken beïnvloedden genen die gerelateerd zijn aan stressrespons in het milieu, chemotaxis/motiliteit van V. cholerae in reactie op fluctuerende omgevingsfactoren, controle van de haaklengte van het flagellum, biofilmvorming in het extra-intestinale milieu, en exponentiële groei in reactie op beschikbare nutriënten (SI Appendix, Fig. S7 en Tabel S7). Milieu-isolaten die succesvol bijdroegen aan de evoluerende milieu-lijn werden niet alleen verzameld in de buurt van ziekenhuizen en cholera-behandelingscentra in Gressier, maar ook in de nabijgelegen regio’s Goave en Carrefour (Fig. 3).
Evolutie en aanpassing van V. cholerae in Haïtiaanse aquatische reservoirs. Fylogenetische verwantschap en geografische verspreiding van 27 omgevingsisolaten verzameld tussen 2012 en 2015 in Haïti. Nonsynonieme mutaties verworven tijdens de evolutie van de omgevingspopulatie, gereconstrueerd door Bayesiaanse gevolgtrekking van voorouderlijke toestanden, zijn aangegeven langs de ruggengraat van de boom. De SNP’s die langs de stam (overlevende lijn) van de boom werden ontdekt, werden opeenvolgend genummerd van 1 tot 7 om de vergelijking met de aanvullende informatie in SI Appendix, tabel S7, te vergemakkelijken. Kaarten tonen de bemonsteringsplaatsen, gegroepeerd per aquatische bron, gelabeld met gele, rode, oranje en cyaan stippen in de regio Gressier, paars voor Carrefour, en blauw in de regio Jacmel.
Het bewijs van epidemiologische en milieu-evolutieve krachten die de Haïtiaanse epidemie aansturen, motiveerde ons om een dynamisch model van cholera-transmissie en populatiegenetica door aquatische milieus en gastheren te overwegen. Zoals in eerdere modellen van cholera van onze groep (27), is ons onderliggend epidemiologisch model gebaseerd op het susceptible-infected-recovered with reservoir (SIRW) raamwerk, een uitbreiding van het klassieke susceptible-infected-recovered (SIR) raamwerk met een toegevoegd compartiment voor pathogeenconcentratie in een aquatisch reservoir (W) (Fig. 4 en SI Appendix, Figs. S8 en S9). In navolging van Kirpich et al. (27) hebben we rekening gehouden met replicatie buiten de gastheer, samen met seizoensgebondenheid in milieuoverdracht, uitscheiding en verval, zoals gesuggereerd door de significante correlatie in het aantal gevallen met de neerslag. Naast deze epidemiologische formulering hebben wij ook een evolutionaire component in ons model opgenomen. Met zowel neutrale drift als selectiedruk wordt rekening gehouden in ons multilocus raamwerk, waarin we Ne meten door genetische diversiteit te berekenen en coalescentiebenaderingen te gebruiken (SI-bijlage, tekst). In overeenstemming met andere studies veronderstelden wij een afweging tussen overlevingskansen in het milieu en fitness in gastheertransmissie voor loci die onder selectie staan. De resultaten van modelsimulaties geven de kwalitatieve kenmerken van Ne en maandelijkse case counts weer (Fig. 4A en SI Appendix, Fig. S8).
Gemengd-transmissiemodel van cholera en voorspelling van vaccinatie. (A) Ne (effectieve populatiegrootte) waargenomen uit gegevens (grijs) en in simulatie met omgevingsreplicatie (groen) en Ne in simulatie zonder omgevingsreplicatie (violet). (B) Verschillende scenario’s van vaccinatie en controle voor de modelsimulatie met milieuvermenigvuldiging, in het bijzonder vaccinatiedekkingsgraden van 64% (snelheid van 0,01 d-1), 88% (snelheid van 0,04 d-1), en 64% bij een toename van 10% van de milieuvervalgraad. Hier definiëren we vaccinatiegraad als het percentage vermindering van vatbare individuen (bij het bereiken van een ongeveer stabiele toestand na 2 tot 3 maanden vaccinatie). In tegenstelling tot Kirpich et al. (27) en simulaties zonder omgevingsreplicatie (SI Appendix, Fig. S10) waarin 64% vaccinatiedekking de ziekteverwekker binnen een jaar uitroeit, is hier ofwel meer vaccinatie (88% dekking) ofwel meer omgevingsverval (10% toename) nodig om cholera onder controle te krijgen in aanwezigheid van omgevingsreplicatie.
Eerst vertonen de modeluitvoer en de gegevens beide een stijging en daling in Ne die aanvankelijk een snelle uitbreiding weerspiegelen, gevolgd door negatieve selectie na de eerste uitbraak (Fig. 4A). Daarna kwam de observatie van een tweede groei in Ne in 2013, groter in omvang dan zou worden verwacht door gastheertransmissie alleen, veroorzaakt door een voorafgaande seizoensgebonden opflakkering en zich uitbreidend in een periode van dalende incidentie. Onze hypothese van diversificatie binnen het aquatische reservoir biedt een verklaring voor deze relatieve opleving in Ne, en wordt ondersteund door redelijke modelsimulaties waar inclusie van omgevingsreplicatie deze evolutionaire exploratie mogelijk maakt in tegenstelling tot gevallen zonder omgevingsreplicatie (Fig. 4A en SI Appendix, Fig. S8). In het bijzonder werden tijdens de piek van eind 2012 tot midden 2013 uuSNPs gedetecteerd in de volgende genen van de overlevende milieu-lijn: Vch1786_I0012 (1 C→T), Vch1786_I0051 gen (3 C→T), Vch1786_I0998 (30 G→A), Vch1786_I1539 (44 A→G), rseA (52 G→A), epsG (61 A→C), en Vch1786_II0794 (107 C→A) (SI Appendix, Fig. S3). Mutaties in deze genen kunnen hebben bijgedragen tot een verhoogde aanpassing van de milieustammen in het aquatische ecosysteem, hoewel toekomstige in vitro studies nodig zullen zijn om hun bijdrage aan de fitness van V. cholerae te onderzoeken. De piek in de omgevingsreplicatie wordt gevolgd door een aanzienlijke daling in Ne die begint vóór de grote stille periode in 2014. Ook hier verklaart de incidentie van de gevallen de omvang van deze daling niet volledig. Hoewel het knelpunt in de populatie een afname van Ne veroorzaakt, suggereren simulaties dat de omgevingsreplicatie noodzakelijk is om de fixatie te versnellen van genen die aangepast zijn aan persistentie in het aquatische reservoir. Aan het eind van 2014 breiden de reservoirs in het milieu zich uit naar de gastheren, met een piek in het aantal klinische gevallen, mogelijk versterkt door een gunstige aanpassing van de gastheer en/of een verlies van immuniteit in de gastheerpopulatie. Uitgebreide simulaties, gekalibreerd aan de casusgegevens, suggereren dat om de waargenomen Ne extra te laten passen, omgevingsreplicatie in het model moet worden opgenomen. Een belangrijk gevolg van onze bevindingen is dat de replicatie en aanpassing binnen het aquatische reservoir bestrijdingsstrategieën gericht op gastheertransmissie kunnen bemoeilijken. In simulaties vanaf 2015 hebben we immers vastgesteld dat vaccinatie de ziekteverwekker gemakkelijk kan verwijderen in afwezigheid van replicatie in het milieu (SI Appendix, Fig. S10). Echter, voor aanpassing aan het milieu en replicatie consistent met de waargenomen Ne, is het vaccineren van een veel groter deel van de bevolking of het toevoegen van een interventie die van invloed is op het aquatische reservoir nodig om cholera te elimineren in ons dynamische gemengde-transmissiemodel (Fig. 4B).