Transmigrated neutrophils in the intestinal lumen engage ICAM-1 om de epitheliale barrière en neutrofielenrekrutering te reguleren
ICAM-1 bevordert PMN adhesie en locomotie op het apicale epitheliale membraan onder ontstekingsomstandigheden
In cryptabcessen, zoals waargenomen bij actieve IBD, worden PMN die de darmcrypten infiltreren vaak waargenomen in intiem contact met het apicale (luminale) epitheliale oppervlak.14 Om PMN-IEC interacties te onderzoeken tijdens de late stadia van TEM, hebben we gemodelleerd PMN migratie over de intestinale epitheel onder inflammatoire omstandigheden met behulp van een eerder beschreven transwell setup.19 PMN TEM in de fysiologische basolaterale-naar-apicale richting over controle of interferon-γ (IFNγ)-behandelde T84 IECs werd geïnduceerd door de toevoeging van een transepitheliale N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLF) gradiënt (100 nM). Blootstelling van T84 IECs aan IFNγ (100 U ml-1, 24 h) had geen significant effect op IEC barrièrefunctie of expressie en subcellulaire lokalisatie van de belangrijkste junctionele eiwitten JAM-A, Occludin, en ZO-1 (Supplementary Figure S1 online). IFNγ behandeling had geen significant effect op het aantal PMN dat TEM voltooide; het verhoogde echter significant het aantal apicaal geassocieerde PMN (van 8,7±1,8%, onbehandeld, tot 19,7±1,9%, IFNγ, apicaal, Figuur 1a). In overeenstemming met deze toename, was het aantal niet gemigreerde PMN (PMN in de bovenste kamer, basaal) significant verminderd (∼1.5-voudig) na IFNγ behandeling, wat duidt op een verhoogde snelheid van migratie (figuur 1a). Het aantal PMN binnen de epitheliale monolaag (epith) was niet veranderd. Representatieve confocale immunofluorescentie beelden (Figuur 1b, bovenste panelen) en z-projecties (onderste panelen) tonen apicaal geassocieerde PMN na migratie over IFNγ gestimuleerd, maar niet controle T84 monolayers. Aangezien IFNγ is eerder aangetoond dat ICAM-1 expressie induceren in ontstoken epitheel,27 we verondersteld dat tijdens ontsteking, PMN migreren over epitheliale monolagen bleef aan de apicale membraan door Mac-1- en ICAM-1-afhankelijke interacties, en dus in staat zou zijn ICAM-1-afhankelijke locomotie zoals eerder is waargenomen in vasculaire endotheel.24, 28 Bevestiging van eerdere bevindingen, IFNγ behandeling (100 U ml-1, 24 uur) induceerde een robuuste, tijdsafhankelijke toename van ICAM-1 expressie (met een piek 24 uur na behandeling, figuur 1c,d) op de apicale membraan van T84 IECs (figuur 1e). Dit effect was specifiek voor IFNγ, aangezien blootstelling van T84 en SKCO15 IECs aan tumornecrosefactor-α (TNFα; 10 ng ml-1) er niet in slaagde ICAM-1 expressie te induceren (Supplementary Figure S2A,B). ICAM-1 upregulatie werd ook waargenomen in de crypt epitheel van colon biopten van patiënten met actieve colitis ulcerosa in vergelijking met gezonde mucosa (figuur 1f). Verder, ter bevestiging van ICAM-1- en Mac-1-afhankelijke PMN adhesie aan apicale IEC membranen, toevoeging van ofwel anti-ICAM-1 of anti-Mac-1 functie-blokkerende antilichamen (Abs; 20 ug ml-1) draaide de IFNγ-geïnduceerde toename van PMN adhesie om (Supplementary Figure S3A). Interessant is dat remming van PMN Mac-1 resulteerde in een sterkere vermindering (>3-voudig) van PMN adhesie in vergelijking met remming van ICAM-1, wat suggereert dat Mac-1 bindt andere epitheliale oppervlak liganden in aanvulling op ICAM-1.
Interferon-γ (IFNγ)-geïnduceerde expressie van intercellulaire adhesiemolecule-1 (ICAM-1) bevordert de retentie van neutrofielen (PMN) op het apicale epitheliale membraan. (a) PMN werd gestimuleerd (100 nM N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLF)) om te migreren over controle of IFNγ-behandelde T84 intestinale epitheelcellen (IECs). Niet gemigreerde PMN (basaal), PMN binnen de epitheliale laag (epith), PMN geassocieerd met de apicale IEC membraan na transepitheliale migratie (TEM) (apicale), en PMN die TEM voltooid (TEM) werden gekwantificeerd. (b) Na 1 uur TEM, werden IEC monolayers gefixeerd en gekleurd voor celkernen (blauw) en PMN Mac-1 (groen). Representatieve beelden tonen verbeterde apicale aanhechting van PMN na migratie over IFNγ-behandelde T84 IECs. Bar = 20 pm. Onderste panelen zijn projecties van beelden die in serie in de z-richting. (c-f) Confluente T84 IECs werden behandeld met IFNγ (100 U ml-1, 24 uur) aan het oppervlak expressie van ICAM-1 induceren. (c) Representatieve flowcytometrie diagram en (d) kwantificering van ICAM-1 expressie in reactie op IFNγ behandeling. ICAM-1 expressie werd geïnduceerd in een tijdsafhankelijke wijze met een piek bij 24 h. (e) T84 IECs werden gefixeerd in ethanol en immunofluorescerend gelabeld voor ICAM-1. Representatief beeld (z projectie van zeven confocale plakjes) toont aan dat ICAM-1 expressie beperkt is tot de apicale epitheliale oppervlak. (f) Niet-geïnflameerde en ontstoken weefsel secties van biopten van menselijke patiënt met colitis ulcerosa werden gekleurd voor ICAM-1 (groen) en kernen (Topro-3, blauw). Representatieve immunofluorescentie beelden tonen de upregulatie van ICAM-1 expressie in ontstoken weefsel (rechter paneel), maar niet in normaal weefsel (linker paneel). Bar = 50 urn. N = 5 onafhankelijke experimenten in drievoud, **P <0.01, two-tailed Student’s t-test (a), analyse van variantie met Newman-Keuls multiple comparison test (d).
PowerPoint slide
Wij onderzochten vervolgens of apicaal vastgekleefde PMN na het oversteken van het epitheel vertoonde apicale locomotie. Fase-contrast time-lapse microscopie werd gebruikt om het gedrag van individuele PMN gehecht aan de IEC apicale membraan volgen en kwantificeren. PMN in de afwezigheid van exogene stimulus vertoonde weinig beweging; echter, 59,3 ± 7,6% van apicaal geassocieerde PMN na migratie over IECs vertoonde een zeer beweeglijk gedrag (figuur 2a) met gemiddelde kruipafstanden van 65,6 ± 6,2 pm (figuur 2b). TEM induceerde een robuuste toename van Mac-1 expressie op het PMN celoppervlak (figuur 2c), in overeenstemming met zijn rol in PMN-IEC apicale interacties. Belangrijk is dat het aantal PMN dat apicale locomotie vertoonde significant werd verhoogd wanneer IECs werden gestimuleerd met IFNγ om ICAM-1 te upreguleren (88±3.6%, IFNγ, vs. 59.3±7.6%, onbehandelde IEC). Onder deze omstandigheden legden PMN aanzienlijk langere afstanden af (101±10,0 μm, IFNγ, vs. 65,6±6,2 μm, onbehandelde IECs, figuur 2b) langs het apicale epitheliale membraan. Bevestigend de rol voor ICAM-1 in het bemiddelen PMN locomotie, toevoeging van een functie-blokkerende anti-ICAM-1 antilichaam (Ab) draaide de IFNγ effecten, vermindering van zowel het aantal en de afstanden afgelegd door PMN (61,4±7,8% en 73,6±6,1 pm, respectievelijk, figuur 2a,b). Remming van Mac-1 afgeschaft locomotie van de resterende aanhangende PMN (Figuur 2a en Supplementary Movies S1 en S2), bevestiging van een exclusieve rol voor Mac-1 in dit proces. De effecten van Mac-1 remming op PMN voortbeweging worden verder benadrukt in time-lapse beeldsequenties (Figuur 2d) en door verplaatsing trajectoriën van zes representatieve PMN (Figuur 2e). PMN kruipen snelheden varieerden van 3 tot 7 pm min-1 en waren niet significant verschillend op niet-gestimuleerde vs IFNγ-gestimuleerde IECs (Supplementary Figuur S3B).
Apisch gehechte neutrofielen (PMN) vertonen intercellulaire adhesie molecule-1 (ICAM-1)- en Mac-1-afhankelijke voortbeweging. (a, b) Na transepitheliale migratie (TEM), werden PMN in staat gesteld zich apicaal te hechten aan intestinale epitheelcellen (IECs), gekweekt in de onderste kamer van transwells. Het aantal PMN vertonen locomotie (a) en de afgelegde afstanden (b) werden gevisualiseerd en gekwantificeerd in de aanwezigheid of afwezigheid van de juiste IgG-controle, of anti-ICAM-1 en Mac-1 functie-blokkerende antilichamen (Abs; 20 ug ml-1), met behulp van fase-contrast time-lapse microscopie (Zeiss, Axiovert microscoop) en ImageJ software. (c) PMN vóór (ononderbroken zwarte lijn) en na TEM (stippellijn) werden geanalyseerd voor Mac-1 expressie met behulp van flowcytometrie. Representatieve stroom diagram (n = 4) toont robuuste upregulatie van Mac-1 op PMN oppervlak na TEM. Het gevulde gebied vertegenwoordigt controle IgG kleuring. (d) Beeldsequentie met representatieve PMN vertonen voortbeweging op T84 IECs in de afwezigheid (bovenste panelen) en in de aanwezigheid van Mac-1-blokkerende Ab (onderste panelen). *Initiële PMN positie, witte pijlen volgen PMN beweging. De stippellijnen markeren het pad afgelegd door PMN meer dan 40 min. Bar = 20 pm. (e) Bewegingstrajecten (in micrometer) van zes representatieve PMN van drie onafhankelijke experimenten over een tijdsperiode van 40 min op het apicale oppervlak van interferon-γ (IFNγ)-gestimuleerde T84 IECs in de afwezigheid (bovenste panelen) en in aanwezigheid van Mac-1-blokkerende Ab (onderste panelen). n=4 onafhankelijke experimenten in duplo, **P<0.01, variantieanalyse met Newman-Keuls multiple vergelijkingstest (a,b).
PowerPoint slide
PMN adhesie aan de apicale epitheliale membraan compromitteert epitheliale barrièrefunctie
We onderzochten vervolgens de effecten van PMN interacties met apicaal tot expressie gebrachte epitheliale liganden op epitheliale barrièrefunctie. In deze experimenten werden PMN apicaal toegevoegd aan confluente T84 IECs gekweekt op permeabele dragers (0,4 μm poriegrootte, te klein om PMN TEM toe te laten), en TER, als een index van epitheliale barrière, werd gemeten over 12-h onder gespecificeerde omstandigheden. De 12-uurs periode werd geselecteerd om de effecten van apoptotische PMN op de epitheliale barrière te voorkomen.29 fMLF (100 nM)-gestimuleerde PMN adhesie aan T84 IECs leidde tot een tijdsafhankelijke daling van TER over een 12-uurs periode (∼60%, figuur 3a). Belangrijk is dat toevoeging van PMN aan de apicale membraan van T84 IECs die waren voorbehandeld met IFNγ, waarvan we hebben aangetoond dat dit leidt tot een verhoogde ICAM-1-afhankelijke PMN-adhesie (figuur 1a), resulteerde in een verdere daling van de TER (∼40% eerste 2 uur en ∼90% gedurende 12 uur). IFNγ-behandeling alleen had geen effect op de TER. Om te testen of de waargenomen toename in epitheliale permeabiliteit te wijten was aan een direct contact tussen epitheliale cellen en PMN, gebruikten we een anti-Mac-1 remmende Ab (CBRM1/29, 20 μg ml-1) om de PMN adhesie aan IFNγ gestimuleerde IECs te remmen. Remming van Mac-1 verminderde de PMN-geïnduceerde afname van de TER na IFNγ-stimulatie aanzienlijk (Figuur 3a). Belangrijk is dat we in aparte experimenten verder hebben bevestigd dat PMN-geïnduceerde daling van de TER in zowel niet-gestimuleerde als IFNγ-behandelde epitheliale monolagen afhankelijk was van direct contact tussen PMN en de apicale epitheliale membraan, en niet gemedieerd werd door paracriene mechanismen. In dergelijke experimenten werden PMN’s toegevoegd aan de onderste kamer van transwells met omgekeerde (apicale zijde naar beneden gericht) T84 monolagen en gestimuleerd met fMLF (100 nM). Onder deze omstandigheden was er geen effect van PMN op de epitheliale barrière, zoals beoordeeld met TER (figuur 3b). Blootstelling van epitheliale monolagen aan 100 nM fMLF gedurende 12 uur had geen significant effect op de TER.
Neutrofiel (PMN) interacties met de apicale epitheliale membraan compromitteren barrièrefunctie. (a) PMN (2,5 × 105 cellen) werden geïntroduceerd op de apicale oppervlak van onbehandelde (controle) of interferon-γ (IFNγ) (100 U ml-1, 24 h)-behandelde T84 intestinale epitheelcellen (IECs) gekweekt op doorlaatbare dragers (0.4 μm filtergrootte, voorkomen PMN transepitheliale migratie (TEM)), in de aan- of afwezigheid van N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLF) (100 nM) en in de aan- of afwezigheid van anti-Mac-1 remmend antilichaam (Ab; 20 μg ml-1). De resulterende veranderingen in TER als een index van epitheliale barrièrefunctie werden gemeten op de aangegeven tijdstippen. PMN contact met apicale epitheliale oppervlak resulteerde in een tijdsafhankelijke daling van de TER, die gedeeltelijk werd omgekeerd met remming van PMN-epitheliale cel interacties. N=4 onafhankelijke experimenten in drievoud, *P<0.05, **P<0.01, en ***P<0.001 significant verschillend van Control+fMLF+PMN, ^^P<0.001 significant verschillend, analyse van variantie met Newman-Keuls multiple vergelijkingstest. (b) PMN’s werden toegevoegd in de nabijheid van de apicale membraan van niet-gestimuleerde (controle) of met IFNγ behandelde IEC’s (IFNγ+PMN+fMLF) zonder direct contact (onderste kamer van transwell-opstelling) in de aanwezigheid of afwezigheid van fMLF-stimulatie (100 nM). Er werden geen veranderingen in de TEW waargenomen, wat contactafhankelijke effecten suggereert. N=4 onafhankelijke experimenten in drievoud.
PowerPoint slide
Ligatie van epitheliale ICAM-1 triggert een MLCK-afhankelijke toename van de intestinale epitheliale permeabiliteit
Wij stelden vast dat apicale upregulatie van ICAM-1 de effecten van Mac-1-afhankelijke PMN-adhesie op de epitheliale barrière aanzienlijk versterkte (figuur 3a). We veronderstelden dus dat de PMN-geïnduceerde toename van de permeabiliteit van met IFNγ behandelde epitheliale monolagen te wijten was aan PMN-contact-gemedieerde ICAM-1-clustering en een inductie van ICAM-1-afhankelijke signaalgebeurtenissen, zoals eerder beschreven in vasculair endotheel.30, 31 T84 IEC monolagen op permeabele dragers werden behandeld met IFNγ om ICAM-1-expressie te induceren, gevolgd door de toevoeging van crosslinking Abs aan ICAM-1. We bevestigden dat Ab-gemedieerde verknoping geïnduceerde ICAM-1 clustering (Supplementary Figuur S2C). Zoals getoond in figuur 4a, Ab-gemedieerde verknoping van ICAM-1 resulteerde in een tijdsafhankelijke daling van TER, die gecorreleerd met verhoogde paracellulaire fluoresceïne isothiocyanaat (FITC)-dextran (3 kDa, figuur 4b). Dit effect was specifiek voor ICAM-1, als verknoping van andere epitheliale oppervlaktemoleculen, major histocompatibility complex-1 (MHC-1; figuur 4), en de bekende PMN ligand, CD55 (Supplementary Figuur S5), had geen significant effect op de permeabiliteit. In overeenstemming met de afwezigheid van ICAM-1 expressie op niet-gestimuleerde T84 IECs, had toepassing van crosslinking Abs op het apicale oppervlak van deze IECs in afwezigheid van IFNγ-stimulatie geen effect op TER (Supplementary Figure S4A). Evenzo, consistent met IFNγ-geïnduceerde ICAM-1 lokalisatie op de apicale epitheliale membraan, toepassing van crosslinking Abs op het basolaterale aspect van epitheliale monolagen had geen significant effect op de barrièrefunctie (Supplementary Figure S4B).
Antibody (Ab)-gemedieerde crosslinking van intercellulaire adhesie molecule-1 (ICAM-1) leidt tot een myosine licht-keten kinase (MLCK)-afhankelijke toename van de epitheliale permeabiliteit. T84 intestinale epitheelcellen (IECs), gekweekt op permeabele dragers, werden gestimuleerd met interferon-γ (IFNγ) (100 U ml-1, 24 uur) om ICAM-1 expressie te induceren. ICAM-1 of controle oppervlakte-eiwit major histocompatibility complex-1 (MHC-1) werden verknoopt door incubatie met primaire Ab (20 ug ml-1, 60 min), gevolgd door passende secundaire antilichamen (20 ug ml-1, 30 min). TER (a) en fluoresceïne isothiocyanaat (FITC)-dextraan (3 kDa) (b) over T84 monolayers voor en na ICAM-1 verknoping werden gekwantificeerd op de aangegeven tijdstippen als een index van epitheliale permeabiliteit. Een farmacologische remmer van MLCK, ML-7 (20 μM), werd een uur voor aanvang van de crosslinking protocollen ingebracht. ICAM-1 ligatie resulteerde in verminderde TER en verhoogde flux van FITC-dextran, en was afhankelijk van MLCK fosforylering. (c) Representatieve western blottings en densitometrische analyse (met ImageJ) tonen verhoogde MLCK fosforylering na ICAM-1 verknoping, die werd omgekeerd met de toevoeging van ML-7. (d) Confocale microscopie en immunofluorescentie labeling werden gebruikt om actine remodeling onderzoeken na verknoping van apicaal tot expressie gebrachte controle receptor MHC-1, en specifiek ICAM-1, in de aanwezigheid of afwezigheid van ML-7 (20 uM). Ab-gemedieerde verknoping van ICAM-1 maar niet MHC-1 resulteerde in verminderde apicale borstelgrens en junctionele actine. Dit effect werd omgekeerd in aanwezigheid van ML-7. Bar = 50 urn. N=4 onafhankelijke experimenten in drievoud (a,b), *P<0.05, **P<0.01 significant verschillend van controle (a), **P<0.01, ***P<0.01, n.s. niet significant, (b,c), analyse van variantie met Newman-Keuls multiple vergelijkingstest.
PowerPoint slide
We hebben eerder aangetoond dat vroege gebeurtenissen in PMN TEM (op het niveau van het basolaterale epitheliale membraan) MLCK-gemedieerde dalingen in TER teweegbrengen.9 Van MLCK is aangetoond dat het een sleutelrol speelt in het reguleren van de epitheliale permeabiliteit door het reguleren van contractie van de perijunctionele actomyosine ring via myosine II regulerende licht-keten fosforylering.32 Wij vroegen ons daarom af of verhoogde IEC permeabiliteit na ligatie van apicaal uitgedrukte ICAM-1 afhankelijk was van MLCK. Inderdaad, Ab-gemedieerde verknoping van ICAM-1 resulteerde in MLCK fosforylering (Tyr 464), consistent met MLCK activering (figuur 4c). Dergelijke activering ging gepaard met verminderde apicale borstelbord en de perijunctionele F-actine (figuur 4d), indicatief voor actine cytoskeletale reorganisatie. Belangrijk is dat remming van ICAM-1 ligatie-geïnduceerde MLCK fosforylering in T84 cellen met ML-7 (20 uM,33 Supplementary Figure S4C) voorkomen ICAM-1-geïnduceerde F-actine reorganisatie (figuur 4d), de daling van TER (figuur 4a), en de toename van paracellulaire dextran flux (figuur 4b). ML-7 behandeling (20 uM) alleen had geen effect op TER. Samen suggereren deze gegevens dat onder inflammatoire condities, PMN contact met de apicale oppervlakte van crypt epitheliale cellen ICAM-1-afhankelijke signaleringsgebeurtenissen triggert, resulterend in verhoogde permeabiliteit.
Engagement van ICAM-1 op het apicale epitheliale membraan vergemakkelijkt versterkte PMN TEM
Als ligatie van apicaal tot expressie gebracht ICAM-1 de epitheliale permeabiliteit verhoogde, voerden we experimenten uit om te onderzoeken of ICAM-1-afhankelijke veranderingen in epitheliale barrièrefunctie zouden resulteren in versterkte PMN TEM. Eerst onderzochten we of PMN die ICAM-1 op de apicale IEC membraan vasthielden, PMN TEM beïnvloedden in de fysiologisch relevante basolaterale-naar-apicale richting.34 In deze experimenten werden PMN gestimuleerd om over epitheliale monolagen te migreren en de getransporteerde cellen werden verzameld en gedurende 1 uur opnieuw aangebracht op de apicale oppervlakte van nieuwe epitheliale monolagen (2.5 × 105 PMN per monolaag) met of zonder IFNγ voorbehandeling. Na 1 uur van PMN-epitheliaal contact, werden de monolagen vrij gewassen van aanhangende PMN en gebruikt voor daaropvolgende PMN TEM assays in de basolaterale-naar-apicale richting. Apicale introductie van PMN aan IFNγ-behandelde, maar niet aan onbehandelde epitheliale monolagen leidde tot een significante toename van PMN TEM (1,7-voudig, Figuur 5a). IFNγ behandeling alleen of PMN aanwezigheid in de buurt van de apicale oppervlak, maar zonder direct contact met monolayers, had geen effect op PMN TEM (figuur 5a). In parallelle experimenten, PMN TEM werd onderzocht na specifieke Ab-gemedieerde verknoping van ICAM-1. In overeenstemming met het effect van ICAM-1 verknoping op IEC barrièrefunctie, Ab-gemedieerde verknoping van ICAM-1 op IFNγ-behandelde T84 IECs aanzienlijk PMN TEM (1,9±voudig, Figuur 5b) verhoogd in vergelijking met verknoping van een apicaal tot expressie gebrachte controle molecuul, MHC-1. Zoals verwacht, toepassing van ICAM-1 verknopingsprotocollen op onbehandelde IEC monolagen had geen significant effect op PMN TEM. Samen suggereren deze bevindingen dat PMN die zich hechten aan de apicale (luminale) IEC membraan door binding van ICAM-1, veranderingen kunnen veroorzaken in de epitheliale barrièrefunctie en kunnen bijdragen aan de regulatie van PMN rekrutering.
Engagement van apicaal tot expressie komende intercellulaire adhesie molecule-1 (ICAM-1) induceert myosine licht-keten kinase (MLCK)-afhankelijke toename van neutrofiele (PMN) transepitheliale migratie (TEM). PMN TEM in de basolaterale-to-apicale richting over onbehandeld (controle) of interferon-γ (IFNγ)-behandeld (om ICAM-1 expressie te induceren) T84 monolayers werd geïnduceerd door een gradiënt van N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLF) (100 nM). (a) Getransmigreerde PMN werden verzameld en geïntroduceerd aan de apicale zijde van nieuwe T84 monolagen in aanwezigheid van fMLF (100 nM), of toegevoegd aan onderste kamers van transwells, met uitzicht op de apicale membraan, maar zonder direct contact met de monolagen (2,5 × 105 PMN per putje, 1 uur). Na het wassen van de apicaal vastgehechte PMN, werd de daaropvolgende PMN TEM gekwantificeerd. PMN apicale interacties specifiek met IFNγ-behandelde T84 intestinale epitheelcellen (IECs) aanzienlijk verhoogd PMN TEM. Dit effect werd omgekeerd in de aanwezigheid van anti-Mac-1 remmend antilichaam (Ab; 20 ug ml-1). Voor alle condities werd het aantal PMN dat na wasbeurten aan de apicale epitheliale membraan bleef kleven bepaald en afgetrokken van het totale aantal getransmigreerde PMN. (b) PMN TEM na Ab-gemedieerde verknoping van ICAM-1 of controle-eiwit (major histocompatibility complex-1 (MHC-1)) werd gekwantificeerd. Kruiskoppeling van ICAM-1 maar niet MHC-1 op met IFNγ behandelde T84-cellen deed de PMN TEM significant toenemen. (c) Controle en IFNγ-behandelde T84 monolagen werden vooraf geïncubeerd met ML-7 (MLCK-remmer, 20 μM) of Blebbistatine (myosine motor II-remmer, 10 μm) alleen of gevolgd door ICAM-1 crosslinking. De effecten van deze remmers op ICAM-1 crosslinking geïnduceerde toename in PMN TEM werden gekwantificeerd. Beide remmers verhinderden ICAM-1 crosslinking-geïnduceerde toename in PMN TEM. Voor alle panelen, de gegevens gepresenteerd als vouw toename boven PMN TEM over niet-gestimuleerde T84 IECs. N=4 onafhankelijke experimenten in drievoud, *P<0,05, **P<0,01, n.s. niet significant, variantieanalyse met Newman-Keuls meervoudige vergelijkingstest.
PowerPoint slide
ICAM-1 crosslinking resulteerde in MLCK activering, wat actine-myosine contractie suggereert (figuur 4). Daarom onderzochten we vervolgens de effecten van MLCK remming en remming van F-actine contractiele krachten op PMN TEM na ICAM-1 crosslinking. Verhoogde PMN TEM geïnduceerd door ICAM-1 verknoping werd omgekeerd wanneer IECs werden voorbehandeld met ofwel MLCK remmer ML-7 (20 pM, 1 h33) of de myosine motor II remmer, Blebbistatine (10 pM, 1 h,35 Figuur 5c). Deze bevindingen suggereren een rol voor actomyosine contractie stroomafwaarts van ICAM-1 in het reguleren van PMN TEM. Behandeling met ML-7 of Blebbistatin alleen had geen effect op PMN TEM (figuur 5c).
Ab-gemedieerde ligatie van ICAM-1 in murine darmlumen leidt tot MLCK-afhankelijke toename van epitheliale permeabiliteit en versterkte PMN rekrutering
Wij voerden vervolgens in-vivo experimenten uit om het effect van ICAM-1 ligatie op intestinale epitheliale barrièrefunctie en PMN rekrutering te onderzoeken, met behulp van een muis intestinale lus model (figuur 6b). In dit model werd de permeabiliteit van intacte, door bloed doorboorde segmenten van de dunne darm beoordeeld na introductie van FITC-dextran in het darmlumen. Zoals getoond in figuur 6a, hoewel ICAM-1 niet werd gedetecteerd in niet-gestimuleerd epitheel (bovenste paneel), resulteerde intraperitoneale (i.p.) toediening van IFNγ en TNFα (500 ng, 24 h) in een robuuste inductie van ICAM-1 expressie. In het bijzonder, geïnduceerde ICAM-1 gelokaliseerd aan apicale regio’s van murine crypt IECs boven Claudin-2 (figuur 6a, onderste paneel). Parallel hieraan zagen we dat cytokine behandeling resulteerde in ∼2-voudige toename van de permeabiliteit van de 3-kDa FITC-dextran (figuur 6c).
Engagement van intercellulaire adhesie molecule-1 (ICAM-1) in murine darm in vivo leidt tot myosine licht-keten kinase (MLCK)-afhankelijke toename van de darmpermeabiliteit. Om ICAM-1 expressie te induceren, werden muizen geïnjecteerd met een mengsel van interferon-γ (IFNγ) en tumor necrose factor-α (TNFα; 500 ng elk, 24 uur, intraperitoneaal (i.p.)). (a) OCT-bevroren segmenten van de darm van muizen werden gesneden (7 pm breed) en immunofluorescent gekleurd voor ICAM-1 (groen) en de tight junction eiwit Claudin-2 (rood). Representatieve confocale beelden tonen apicale inductie van ICAM-1 expressie (witte pijl) na IFNγ / TNFα behandeling (onderste paneel) in vergelijking met niet-geactiveerde weefsel (bovenste paneel). Bar = 50 pm. (b) Cartoon toont de muis intestinale lus model zoals beschreven in Methods. (c) In-vivo intestinale epitheliale permeabiliteit werd gemeten onder de opgegeven omstandigheden zoals beschreven in Methodes. ICAM-1 staart peptide (100 pm ml-1) werd luminaal ingebracht 30 min voor ICAM-1 crosslinking protocollen. MLCK inhibitor ML-7 (20 uM) werd ingebracht door i.p. injectie 2,5 uur voor ICAM-1 crosslinking. Verhoogde fluoresceïne isothiocyanaat (FITC)-dextraan flux na antilichaam (Ab) verknoping van ICAM-1 werd voorkomen met zowel de toevoeging van ICAM-1 staart peptide en voorbehandeling met ML-7. N=4 muizen per conditie, *P<0.05, variantie-analyse met Newman-Keuls multiple vergelijkingstest.
PowerPoint slide
Belangrijk is dat de invoering van ICAM crosslinking Abs, maar niet Abs aan het controle-eiwit, MHC-1 in het lumen van cytokine gestimuleerde darmlussen geïnduceerd een verdere ∼1.5-voudige toename van de permeabiliteit voor dextran in vergelijking met cytokine behandeling alleen (figuur 6c). Om te bevestigen dat de toename van de intestinale epitheliale permeabiliteit specifiek werd gemedieerd door epitheliale ICAM-1-geïnduceerde signaalgebeurtenissen, gebruikten we peptiden afgeleid van het cytoplasmatische domein van ICAM-1 (ICAM-1 peptide) om het vermogen van ICAM-1 te remmen om stroomafwaartse signaalgebeurtenissen te mediëren. Eerder is in vasculair endotheel aangetoond dat ICAM-1, maar niet het controlepeptide, interacties tussen ICAM-1 en doeleiwitten remt, waardoor ICAM-1-afhankelijke signalering wordt voorkomen zonder de binding aan extracellulaire leukocytenliganden te beïnvloeden.22, 24 Toevoeging van ICAM-1, maar niet het controlepeptide (100 μg ml-1, 30 min), remde ICAM-1 ligatie-geïnduceerde toename van de darmpermeabiliteit (figuur 6c). Abs intraluminaal ingebracht in darmlussen (niet gestimuleerd en na IFNγ/TNFα activering) werden bevestigd dat ze het epitheel niet overstaken, waardoor de mogelijke indirecte bijdrage van lamina propria cellen aan de waargenomen effecten wordt uitgesloten (Supplementary Figure S6).
In verdere ondersteuning van de rol van MLCK in ICAM-1-gemedieerde signalering, remming van MLCK activering met ML-7 (1 mg kg-1, i.p.36) vóór ICAM-1 verknoping de toename van de permeabiliteit voorkomen (figuur 6c). Deze gegevens tonen aan dat verhoogde intestinale epitheliale permeabiliteit in vivo na ICAM-1 ligatie MLCK dependent.
Aangezien verhoogde epitheliale permeabiliteit wordt geassocieerd met verhoogde PMN migratie, vroegen we ons af of ligatie van ICAM-1 zou leiden tot verhoogde PMN rekrutering in vivo. Met behulp van de murine darmlus model, PMN infiltratie in de darm mucosa en migratie in het lumen werd geïnduceerd door luminale toediening van chemoattractant CXCL1 (1 uM in 200 ul Hank’s evenwichtige zoutoplossing (HBSS)+) en gekwantificeerd door immunofluorescentie labeling / confocale microscopie en analyse van lavaged vloeistof bereid op cytospins, en gekleurd met Diff-Quik, respectievelijk. In afwezigheid van chemoattractant, werden PMNs niet gedetecteerd in het darmepitheel of in het darmlumen (niet getoond); echter, luminale toediening van CXCL1 veroorzaakte aanzienlijke PMN migratie in de epitheliale laag (figuur 7a) en accumulatie in het darmlumen (figuur 7c). In overeenstemming met de cytokine-geïnduceerde toename van de permeabiliteit, IFNγ / TNFα behandeling verhoogd met ∼ 2-voudige het aantal PMN in het darmepitheel, en ∼ 1,7-voudige in het lumen. Belangrijk is dat toevoeging van ICAM-1 verknoping Abs in het lumen van cytokine behandelde darmlussen verder verhoogd (over cytokine behandeling alleen) het aantal PMN zowel in het epitheel (∼1.6-voudig, Figuur 7a,b) en in het lumen (∼1.4-voudig, Figuur 7c,d). PMN (groen) infiltreren het darmepitheel (rood) worden getoond in representatieve beelden van weefselsecties van cytokine-geactiveerde darmlussen na ICAM-1 ligatie (figuur 7b). Evenzo PMN die gemigreerd in het lumen na ICAM-1 ligatie worden getoond in representatieve beelden van lavage vloeistoffen van intestinale lussen (figuur 7d).
Engagement van intercellulaire adhesie molecule-1 (ICAM-1) in murine darm in vivo leidt tot myosine licht-keten kinase (MLCK)-afhankelijke toename van neutrofielen (PMN) rekrutering. PMN transepitheliale migratie (TEM) in de murine darmlus model werd geïnduceerd door luminale introductie van CXCL1 (1 uM in 200 ul Hank’s gebalanceerde zoutoplossing (HBSS)+). (a) PMN in de mucosale epithelia werden gekwantificeerd uit cryosecties van de darm lus immunofluorescent gelabeld voor PMN (groen) en F-actine (rood). (b) Representatieve beelden tonen robuuste PMN infiltratie na ICAM-1 verknoping (rechter paneel) in vergelijking met darmweefsel zonder introductie van CXCL1, waar PMN zijn gelokaliseerd in de bloedvaten (witte pijl). Bar = 50 urn. (c) PMN die in het lumen migreerden werden geïsoleerd door lavage en gekwantificeerd van cytospins gekleurd met Diff-Quik. Gegevens gepresenteerd als percentage van alle cellen in de lavage vloeistof. (d) Representatieve beelden van de cytospins tonen getransmigreerde PMN in de intestinale luminale lavage na ICAM-1 crosslinking (rechter paneel, PMN worden aangeduid met witte pijlen). PMN worden niet gedetecteerd in het intestinale lumen zonder de introductie van de chemoattractant (linker paneel). Balk = 10 μm. N=4 muizen per conditie, *P<0.05, variantie-analyse met Newman-Keuls multiple comparison test.
PowerPoint slide
Consistent met ICAM-1 ligatie-geïnduceerde toename van de epitheliale permeabiliteit, verhoogde PMN migratie in het darmlumen was afhankelijk van ICAM-1-gemedieerde signalering gebeurtenissen en MLCK activering. Zowel intraluminale toevoeging van ICAM-1 peptide, maar niet de controle peptide (niet getoond; 100 ug ml-1, 30 min), en remming van MLCK (ML-7, 1 mg kg-1, i.p.) vóór Ab-gemedieerde crosslinking van ICAM-1 volledig geremd ICAM-1 ligatie-geïnduceerde toename in PMN migratie (figuur 7a, c). Deze bevindingen suggereren dat engagement van ICAM-1 op het apicale darmepitheliale membraan onder ontstekingsomstandigheden de barrièrefunctie compromitteert, waardoor verhoogde PMN rekrutering in vivo wordt vergemakkelijkt.