Den genetiske variation af forskellige udviklingsstadier af Schistosoma japonicum: gavner fordelingen i snegle og parringspræference transmissionen?
Proveindsamling
Proveindsamling og forsøgsdesign er opsummeret i fig. 1. Prøveindsamlingens trin er skitseret nedenfor, herunder indsamling af snegle, indsamling af cerkarier, indsamling af infektion af mus og voksne orme samt indsamling af miracidier.
Flowchart over prøveindsamling og forsøgsdesign
Snegleindsamling
Oncomelania hupensis-snegle blev indsamlet i marts og september 2016 fra det østlige område af Dongting-søen (29° 32′ 5.25″ N, 112° 52′ 35.00″ Ø), Hunan-provinsen, Kina. Sneglene blev fundet i grøfter i 3 landsbyer i en afstand på 10 km. Indsamlingsstedet er et sumpområde og ikke en nationalpark eller et andet beskyttet område eller privat jord. Indsamlingerne blev foretaget med tilladelse og bistand fra Institute of Schistosomiasis Control of Hunan Province, Kina, som fører tilsyn med sneglebekæmpelsen i området. Oncomelania hupensis er ikke en truet eller beskyttet art. Sneglene blev bragt tilbage til laboratoriet og klassificeret som gruppe A for de snegle, der blev indsamlet i marts, og gruppe B for de snegle, der blev indsamlet i september. Efter en måneds fangenskab blev sneglene vasket og overført til individuelle vandfyldte glas i 3 timer under lys ved 25 °C for at stimulere fremkomsten af cerkarier med henblik på identifikation af S. japonicum-infektion. Endelig blev 20 snegle fra gruppe A og 25 snegle fra gruppe B identificeret som værende inficeret med S. japonicum.
Cerkarieindsamling
Når cerkarier blev frigivet fra de enkelte snegle, blev nogle af dem overført til en skål ved hjælp af en løkke og vasket i cerkarievaskeopløsning (5 g/l lactalbuminhydrolysat, 6,8 g/l NaCl, 0,4 g/l KCL, 0,2 g/l CaCl2, 0,2 g/l MgSO4-7H2O og 1 g/l glukose) under mikroskopi. Efter 3 vaske blev cerkarierne pipetteret enkeltvis med 2 μl steriliseret vaskeopløsning på et Whatman™ FTA-kort (GE Healthcare, Pittsburgh, USA). Efter tørring blev kortene opbevaret i en forseglet plastpose i en ekssikkator ved stuetemperatur. Mindst 50 cerkarier pr. snegl blev indsamlet individuelt og opbevaret på Whatman™ FTA-kort.
Musinfektion med cerkarier fra den enkelte snegl
For at skelne mellem S. japonicum-inficerede snegle af enkeltkøn blev 2 laboratoriekunming-mus perkutan inficeret med 30 cerkarier fra hver snegl pr. mus. I alt blev 40 mus inficeret for 20 snegle i gruppe A, og 50 mus blev inficeret for 25 snegle i gruppe B. Orme blev hentet fra de mesenteriale vener i hver mus ved perfusion med 0,9 % NaCl og dissektion 7 uger senere efter infektion. Der blev sørget for at minimere risikoen for spaltning af parrede voksne orme forårsaget af mekanisk kraft under perfusion og dissektion, idet der blev anvendt 3 erfarne teknikere til at behandle ormene så hurtigt som muligt. Hvert par af orme blev overført til separate rør til vask og mærkning med det samme og blev opbevaret i absolut ethanol parvis, når de havde delt sig spontant. Uparrede orme fra hver mus blev kontrolleret under mikroskopi for at bekræfte kønnet og derefter opbevaret i ethanol.
Mus-infektion med cerkarier puljet fra alle snegle (metode I og II) og indsamling af voksne orme
For efterfølgende infektioner forblev 17 af de 20 snegle fra gruppe A og 16 af de 25 fra gruppe B i live og i stand til at producere tilstrækkelige cerkarier. Der blev anvendt to forskellige metoder til samling af cerkarier til de to grupper af snegle. For de 17 resterende snegle i gruppe A blev alle snegle samlet i en kolbe med vand for at stimulere fremkomsten af cercariaer (metode I). Herefter blev 31 mus inficeret perkutant med 34 cercariae for hver mus. Ved infektionen med 16 snegle i gruppe B blev 2 cerkarier fra hver snegl, der udgik individuelt, lagt sammen, og de blandede 32 cerkarier blev anvendt til at inficere en mus (metode II), idet de blev gentaget for at inficere i alt 22 mus. Alle musene blev ofret for at indsamle S. japonicum-orme 7 uger efter infektionen som beskrevet ovenfor. Endelig blev der indsamlet 530 orme fra mus efter metode I (gruppe A) og 484 orme fra mus efter metode II (gruppe B).
Miracidieindsamling
Hvor alle inficerede mus blev ofret for at indsamle voksne orme, blev der indsamlet afføring fra hver mus i 7 dage for at koncentrere æg, der blev udskilt gennem tarmen med henblik på udklækning af miracidier. Ægsedimentet fra hver mus blev udsat for dechloreret vand i en kolbe under lys ved 25 °C for at udklække miracidier. Miracidier blev høstet fra det øverste vand i hver kolbe med en pipette og overført til en skål med miracidievaskeopløsning (5 g/l lactalbuminhydrolysat, 6,5 g/l NaCl, 0,14 g/l KCl, 0,12 g/l CaCl2 og 0,20 g/l NaHCO3). Efter 3 vaske blev miracidier pipetteret enkeltvis med 2 μl steriliseret vaskeopløsning på et Whatman™ FTA-kort. Efter at være blevet tørret, blev kortet opbevaret i en forseglet plastpose i et eksikkator ved stuetemperatur. Der blev indsamlet mindst 50 miracidier pr. muses afføring.
Miracidier, der var klækket fra æg fanget i lever af inficerede mus, blev også indsamlet på følgende måde. Leveren af hver inficeret mus blev indsamlet efter indsamling af voksne orme, homogeniseret i koldt 1,2 % NaCl og filtreret for at opnå ægsedimentet. Miracidier blev udklækket ved hjælp af samme metode som den, der blev anvendt til afføringsprøven. Endelig blev mindst 50 miracidier pr. muselever pipetteret enkeltvis og opbevaret på Whatman™ FTA-kort.
Genomisk DNA-ekstraktion
For DNA af en enkelt cercaria- eller miracidieprøve blev en skive med en diameter på 2 mm fjernet fra midten af hvert prøvepipetteringsområde på et Whatman™ FTA-kort ved hjælp af en 2 mm Harris Micro-punch (GE Healthcare Life Sciences, Stevenage, UK). Disken blev anbragt i bunden af en 96 brønde, 1,2 ml U-bundplade. Efter en vask med 100 μl FTA-rensningsreagens (GE Healthcare Life Sciences) i 5 minutter efterfulgt af 100 μl TE-buffer (10 mM Tris-Cl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0) blev 14 µ 0,1 M NaOH med 0,3 mM EDTA, pH 13,0, tilsat til hver brønd, hvorefter opløsningen blev ladt inkubere i 5 minutter, hvorefter 26 µl 0,1 M Tris-HCl-buffer, pH 7,0, blev tilsat. Derefter blev pladen blandet ved at pulse med en vortex-mixer 3 gange i ca. 10 sekunder hver gang. Opløsningen blev derefter efterladt ved stuetemperatur i 10 min., pulsevortexet 10 gange, og eluatet blev overført til en ren 96-well-plade og opbevaret ved – 20 °C til videre brug.
Med hensyn til individuelle voksne orme blev den forreste del, herunder livmoderen, afskåret under mikroskopi fra hver voksen hunorm for at undgå, at æg i livmoderen påvirkede hunormens genotype. Mens hele hanorme eller umodne hunorme blev anvendt til DNA-udtrækning. Det samlede genomiske DNA blev ekstraheret individuelt fra hver orm ved hjælp af en standardprocedure med natriumdodecylsulfat-proteinase K på følgende måde. Hver orm blev inkuberet og optøet i 400 μl ekstraktionsbuffer indeholdende 50 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1 % SDS og 100 mg/ml proteinase K, ved 56 °C i 1 time under forsigtig omrøring. DNA i opløsningen blev ekstraheret ved hjælp af standard phenol/chloroform-rensning, efterfulgt af 3 M natriumacetat (pH 5,2) og ethanoludfældning. Pellets af DNA blev vasket i 70 % ethanol, lufttørret og resuspenderet i 20 μl TE (pH 8,0) og opbevaret ved – 20 °C som rå DNA-ekstrakt af voksen orm til videre brug.
PCR-amplifikation og mikrosatellitgenotypering
For at bekræfte, at der fandtes genomisk DNA i FTA-kortudvaskning eller råekstrakt fra ethanolopbevaret prøve, blev 28S ribosomalt DNA-genfragmentet amplificeret fra DNA-opløsning af en enkelt cercaria, miracidium eller voksen orm ved hjælp af følgende primere: fremadrettet (5′-GTG GAG TTG TTG AAC TGC AAG C-3′) og omvendt (5′-GCT CAA CAA CAW TAA TAG TCA AAC CTG-3′). PCR’erne blev udført ved hjælp af Illustra PuReTaq Ready-To-Go PCR-beads i en 96-hulsplade (GE Healthcare Life Sciences, USA). For hver perle blev der tilsat 2 µl FTA-elution fra en enkelt larve eller 0,5 µl råekstrakt fra en enkelt orm med 1 µl af hver primer og vand til et slutvolumen på 25 µl. Amplifikationen blev gennemført med følgende program: 95 °C i 5 min; efterfulgt af 40 cyklusser på 30 s ved 95 °C, 30 s ved 60 °C og 40 s ved 72 °C; og et sidste forlængelsestrin ved 72 °C i 7 min. Reaktioner blev derefter kontrolleret ved at køre 5 µl på en 2 % agarose TAE-gel.
Genotypebestemmelse i lille skala blev udført for 30 cercariae, 30 miracidier og 30 orme, som blev udvalgt tilfældigt, for at konstruere et optimalt multiplex mikrosatellit loci-panel til PCR-amplifikation. Tyve loci, der er udviklet og valideret i tidligere undersøgelser og fra vores laboratorium, blev kontrolleret. Endelig blev 9 mikrosatellitloci (Additional file 1: Table S1) udvalgt til at udgøre panelet. Mikrosatellitloci for hver DNA-prøve blev genotypet ved hjælp af Type-it Microsatellite PCR-sættet (Qiagen, Manchester, UK) med multiplex af 9 loci. Den fremadrettede primer i hvert par blev mærket med et passende fluorescerende farvestof, herunder 6-FAM, HEX, TAMRA og ROX (Additional file 1: Tabel S1). PCR-reaktioner blev forberedt i en 96-well PCR-plade ved hjælp af 6,25 µl 2× mastermix, 1,25 μl Q-opløsning, 0,5 μl primere (10 μM), 2 μl DNA-template og 2,5 μl ddH2O, hvorefter de blev udført i en Bio-Rad termocycler med følgende program: 95 °C i 5 minutter, efterfulgt af 35 cyklusser på 30 sekunder ved 95 °C, 90 sekunder ved 60 °C og 3 minutter ved 72 °C, efterfulgt af et sidste forlængelsestrin ved 60 °C i 45 minutter. PCR-reaktionerne blev kontrolleret ved at køre 5 µl på en 2 % TAE-agarosegel, og vellykkede amplifikationer blev sendt til Sangon Biotech (Shanghai, Kina) med henblik på fragmentanalyse på en ABI3100 genetisk analysator (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Genotyperne blev scoret ved hjælp af et mikrosatellit-plugin i Geneious 11.0 . Alle prøver blev amplificeret og genotypet to gange for at reducere afvigelsen. I alt blev der genereret genotyper af 346 cerkarier, 701 voksne orme og 393 miracidier til de følgende analyser.
Genetiske diversitetsanalyser
Genetisk diversitet for hvert locus blev estimeret i alle genotypede cerkarier ved at beregne det observerede antal alleler (Na), det effektive antal alleler (Ae) i GenAlEx 6.5 og allelrigdom (Ar) og gendiversitet (Hs) i hierfstat ver. 0.04-22 , herunder 156 cerkarier fra 20 snegle fra gruppe A og 190 cerkarier fra 25 snegle fra gruppe B. Afvigelse fra Hardy-Weinberg-ligevægt (HWE) for hvert locus blev testet med Chi-square-testen i GenAlEx, og linkage disequilibrium-testen mellem loci blev beregnet i SHEsis .
Na, Ae, Ar og Hs blev beregnet for forskellige populationer under museinfektionsprocessen på følgende måde. For cercariapopulationer, der blev anvendt ved infektionen, blev 132 cercariae fra 17 snegle i gruppe A (anvendt i metode I) og 122 cercariae fra 16 snegle i gruppe B (anvendt i metode II) vurderet. Efter genotypning og filtrering af data af lav kvalitet blev mindst 5 par voksne orme (når de var til stede) og alle uparrede orme fra hver mus genotypet med succes. I alt 357 orme fra mus i metode I (ved hjælp af cerkarier fra 17 sammenlagte snegle fra gruppe A) og 344 orme fra mus i metode II (ved hjælp af lige blandede cerkarier fra 16 individuelle snegle fra gruppe B) blev inddraget. Desuden blev den genetiske diversitet af voksne orme i hver mus vurderet for at kontrollere den alleliske konsistens af voksne orme blandt musene i metode I og II separat. For miracidiepopulationer blev den genetiske diversitet af miracidier fra lever og afføring beregnet på overpopulationsniveau (miracidier fra lever eller afføring fra alle mus), da der kun blev genotypet 3-4 miracidier fra lever eller afføring i hver mus, herunder 93 miracidier fra lever (3 pr. mus) og 124 miracidier fra afføring (4 pr. mus) i metode I og 88 miracidier fra både lever og afføring (4 pr. mus hver for sig) i metode II.
Analyse af molekylær varians (AMOVA)
Den genetiske differentiering af alle genotypede cercariae fra gruppe A og gruppe B blev estimeret ved hjælp af AMOVA i Arlequin ver. 3.5.2.2 . Efter udelukkelse af snegle, der ikke blev anvendt til infektion af mus, blev differentieringen mellem 132 cerkarier fra 17 snegle i gruppe A (for metode I) og 122 cerkarier fra 16 snegle i gruppe B (for metode II) testet. Efter infektion blev differentieringen mellem 357 voksne orme i metode I og den oprindelige cercariapopulation (132 cercariae fra gruppe A) testet. Desuden blev de 344 orme i metode II testet i forhold til de 122 cerkarier fra gruppe B. Desuden blev variationen af voksne orme blandt 31 mus i metode I og voksne orme blandt 22 mus i metode II vurderet separat. For miracidier blev den genetiske differentiering testet mellem 93 miracidier fra lever og 124 miracidier fra afføring i metode I, og det samme for 88 miracidier fra både lever og afføring i metode II.
Slægtsskabsanalyse for singletoner af cercariae med niMLGs
Antal af cercariagenerotyper fra hver snegl blev talt. Da det er vanskeligt at skelne typningsfejl eller somatisk mutation under sporocystformering fra den oprindelige miracidiumgenotype, blev en gruppe cercariagenerotyper med færre end 2 mismatchede alleler identificeret som niMLG’er og henført til en slægt, der stammer fra det samme miracidium i hver snegl. Endelig blev antallet af miracidier, der etablerede genetiske kloner i hver snegl, vurderet på grundlag af slægtsnummeret ved hjælp af R-pakken allelematch ver. 2.5 .
Da cerkarier med niMLG’er i en snegl formodes at stamme fra ét miracidium , blev en af genotyperne (singleton) for niMLG’er tildelt til at repræsentere en gruppe af cerkarier, der stammer fra et miracidium med funktionen amCluster i allelematch, for at fremstille det filtrerede datasæt til slægtskabsanalyse mellem miracidier. Derefter blev slægtskabet mellem singletons (miracidier) vurderet ved hjælp af allelstørrelseskorrelationskoefficienten (I′) i henhold til Streiff i SPAGeDi ver. 1.5a på intra-snegle- og inter-snegle-niveau for 20 snegle i gruppe A og 25 snegle i gruppe B for at finde ud af, om sammenlægning af miracidier i en snegl korrelerede med den genetiske lighed mellem miracidier.
Allelfordeling for cercaria-undergrupper fra de forskellige antal snegle
Den uensartede genetiske fordeling af cercariaer blandt snegle indebærer, at stikprøvestørrelsen af snegleværter ville påvirke allelfordelingen af cercaria-suprapopulationen (cercariaer fra alle snegle). Na, det grundlæggende indeks til angivelse af genoverflod i en population , blev yderligere evalueret for hvert locus i forskellige cerkarieundergrupper ved at udvælge forskellige antal snegle tilfældigt. Sneglene blev udvalgt tilfældigt for hvert givet antal snegle, som blev sat fra 1 til maksimum i hver gruppe ved hjælp af basisfunktionen sample i R, med 100 gentagelser. Under hver gentagelse blev antallet af cerkarier i hver snegl sat til 5, hvilket blev fastsat i overensstemmelse med den praktiske gennemførlighed og det gennemsnitlige antal cerkarier, der blev genotypet i hver snegl i denne undersøgelse. Genotyperne af cercariae for det samme antal snegle blev slået sammen, og Na blev derefter estimeret for hvert locus med funktionen nb.alleles i R-pakken hierfstat. Relativiteten mellem genetisk diversitet og snegleantal blev evalueret ved at beregne den mindste stikprøvestørrelse af snegle, når 50 % og 95 % af den samlede Na blev fastsat.
Genetisk afstand mellem voksne hun- og hanorme
For at påvise en potentiel genetisk præference for S. japonicum under parring blev den interindividuelle genetiske afstand Dsw mellem hannen og hunnen i hvert par i individuelle mus målt med Populations ver. 1.3.32 (http://www.bioinformatics.org/~tryphon/populations/) og sammenlignet med afstanden mellem den parrede hun og uparrede orme (hvis tilgængelig, er uparrede for det meste hanner) i samme vært.
Fædrelighedsidentifikation for miracidier
Allelfrekvenserne for alle voksne orme og miracidier i hver mus blev analyseret og beregnet ved hjælp af funktionen Allele Frequency Analysis i Cervus 3.0 . Alle 9 loci blev endelig vurderet som egnede markører til yderligere afstamningsanalyse med en kombineret ikke-udelukkelsessandsynlighed på mindre end 0,01 %. Funktionen Simulation of Parentage Analysis blev anvendt på grundlag af allelfrekvensen til at vurdere opløsningsevnen af kodominante loci og kritiske værdier for log-likelihood (LOD) med følgende antagelser: 10 000 afkom (miracidier) for hver enkelt mus; 10 kandidatmødre og -fædre i hver mus (anslået stikprøvestørrelse i henhold til antallet af voksne orme indsamlet i en vært); andelen af kandidater blev sat til 100 % af de genotypede voksne orme; andre indstillinger var indstillet som standard. Endelig blev begge output fra Allelfrekvensanalysen og Simulering af afstamningsanalyse refereret i modulet Afstamningsanalyse for at tildele hvert afkom til dets mest sandsynlige forældre. De forældre, der har mere end 2 alleler, der er mismatchet med afkommet, blev udelukket, og de forældre, der havde den største LOD, blev anset for mest sandsynlige som forældre.
Statistisk analyse
Alle data, der anvendes i den statistiske analyse i denne undersøgelse, er kontinuerlige data. Signifikansen af forskellen på genetiske diversitetsindeks (Na, Ae, Ar og Hs) for loci, slægtskabskoefficient (I′) og interindividuel genetisk afstand (Dsw) mellem to grupper blev evalueret med et signifikansniveau på 0,05. Først blev datasættenes normalfordeling kontrolleret med Sharpiro-Wilk-testen. Derefter blev der anvendt parvise stikprøver/uafhængige t-test, når datasættene opfyldte normalfordelingen. Ellers blev Wilcoxon signed-rank-test og Mann-Whitney U-test anvendt for de beslægtede/uafhængige prøver. Bonferroni-korrektion blev anvendt til at korrigere P-værdien ved flere sammenligninger.