E-cadherin binder til desmoglein for at lette samling af desmosomer
1) Denne artikel omhandler mekanismen for cadherin-medieret regulering af samling af desmosomer. Selv om anmelderne er enige i, at arbejdet er potentielt spændende, rejste de flere væsentlige spørgsmål. For det første er alle enige om, at modellen skal testes ved at undersøge samlokalisering i celler, der udtrykker cadherinmutanten.
Vi takker anmelderne for at foreslå disse vigtige eksperimenter. Som beskrevet i vores detaljerede svar til anmelderne har vi nu testet den rolle, som de forskellige Ecad-mutationer spiller i forhold til at hindre rekruttering af Dsg2 i keratinocytter. Vi udtrykte fuld længde Ecad WT og Ecad-mutanter (L175D, K14E og W2A-K14E) i Ecad-knockout, Pcad-knockdown-muskeratinocytter (EKO/PKD) og analyserede Dsg2-rekruttering til steder med intercellulære kontakter. Disse resultater bekræfter, at aminosyre L175 på Ecad medierer Dsg2-interaktioner og letter tidlig desmosomkompleksdannelse i celler. Vores eksperimenter afslører også, at desmosom samling initieres på steder med Ecad trans homodimerisering.
2) Der er også bekymringer om pålideligheden af samlokaliseringsdataene i figur 5; en mere stringent analyse er nødvendig for at vise, at samlokalisering af E-cadherin og desmoplakin forekommer meget mere end det ville blive forventet ved en tilfældighed.
I marken identificeres desmosomer ved størrelsen og jernbanesporets udseende af DP farvning i SIM-billeder. Som skitseret i vores svar til anmelderne brugte vi denne etablerede fremgangsmåde til at lokalisere desmosomer. Desuden understreger vi nu, at vi ikke måler kolokalisering, men snarere rekruttering af forskellige cadheriner (Ecad og Dsg) til regioner af membranen, der viser dette mønster.
3) For det andet antager modelleringen, at L175 udgør en del af grænsefladen, men uden vurdering af stoichiometri kan det ikke udelukkes, at tabet af binding er en indirekte effekt af tab af cis-dimerisering. Modelleringen betragtes også som svag, da der ikke blev testet komplementære grænseflader på Dsg2. Uden sådanne data må den molekylære modellering betragtes som meget spekulativ.
Som beskrevet i vores detaljerede svar til anmelderne viser tidligere beregningssimuleringer og biofysiske eksperimenter, at Ecad cis-dimerdannelse kræver forudgående trans-dimerisering. Derfor kan Ecads ikke binde til overfladen som selvstændige, forud dannede cis-dimere. Dette gør det yderst usandsynligt, at de målte bindingsinteraktioner forekommer mellem Ecad cis-dimere og Dsg2. Ikke desto mindre er vi enige med anmelderne i, at de molekylære dockingresultater er ret svage. Vi har derfor fjernet disse modelleringsresultater fra manuskriptet.
4) Endelig, som bemærket af anmelder 3, forklarer modellen og diskussionsafsnittet, selv om de understøttes af disse tilføjelser, ikke rigtig, hvordan E-cadherin regulerer desmosomer.
Baseret på vores nye cellulære struktur-funktionsdata foreslår vi nu en model, hvorefter desmosomassamlingen fremmes både af de direkte cis-interaktioner mellem Ecad og Dsg2 og trans-bindingen af modsatrettede Ecad. I vores model tjener trans-homodimeriseringen af Ecad fra modsatte celler som et rumligt signal til koordinering af desmosom-samlingen. Ecad danner efterfølgende cis-dimerkomplekser med Dsg2 for at initiere desmosomopsamling. Modellen præsenteres og diskuteres i det nye manuskript.
Reviewer #1:
1) Single-molekyle AFM-eksperimenterne er den mest solide del af artiklen. I min læsning udelukker forfatterne imidlertid ikke muligheden for, at de bindingsbegivenheder, de observerer, kan skyldes interaktioner mellem præ-formede E-cadherin cis-dimere. Støkiometrien af interaktionen er vigtig at fastslå, da hvis binding til Dsg2 involverede krævede en E-cadherin cis-dimer, ville det ændre fortolkningen af resultatet, at L175D-mutationen blokerer Dsg2/E-cad-interaktionen. Et sådant scenarie ville også udfordre gyldigheden af docking-simuleringerne. Efter min opfattelse er den lave sandsynlighed for binding pr. kontakt mellem AFM-spidsen og overfladen et svagt bevis for, at bindingen nødvendigvis afspejler interaktionen mellem to monomerer, ligesom den lave gennemsnitlige tæthed af cadherinmolekyler på overfladen heller ikke er et bevis for, at bindingen nødvendigvis afspejler interaktionen mellem to monomerer. Endvidere er cadherinerne immobiliseret med streptavidin, som har flere biotinbindingssteder.
Af disse grunde mener jeg, at det er vigtigt at bevise, at der sker heterodimerisering mellem monomerer. For at gøre dette vil jeg anbefale systematisk måling af spidens interaktionssandsynlighed med overfladen som en funktion af den arealmæssige overfladetæthed af E-cadherin på dækglasoverfladen. Hvis interaktionen rent faktisk kræver monomerisk E-cadherin, bør denne måling skalere lineært med tilsat E-cadherin, i det mindste ved lave tætheder. Denne specifikke måling er imidlertid ikke nødvendig – enhver måling, der fastslår stoichiometrien, er tilstrækkelig.
Forrige computersimuleringer (Wu et al., 2010; Wu et al., 2011) har vist, at Ecad cis-homodimerisering kræver forudgående Ecad trans-dimerdannelse. Tilsvarende har tidligere FRET-målinger af enkeltmolekyler vist, at det ikke er muligt at danne enkeltstående Ecad cis-dimere, selv når Ecad-monomerer er placeret tæt på hinanden i en cis-orientering (Zhang et al., 2009). Samlet set tyder disse resultater på, at Ecads i vores eksperimenter ikke kan immobiliseres på AFM-spidsen eller substratet som præ-formede cis-dimere. Følgelig skyldes Ecad-L175D-mutantens manglende interaktion med Dsg2 ikke fraværet af Ecad-cis-dimerisering. Vi diskuterer nu dette i underafsnittet “Leu 175 medierer Ecad- og Dsg2-interaktioner” i manuskriptet.
Der er desværre tekniske begrænsninger, der ikke tillader det proteinstoiometrieksperiment, som anmelderen foreslår. I vores eksperimenter bruger vi proteinoverfladetætheder, der giver os mulighed for entydigt at identificere enkelte bindingsbegivenheder ud fra den tilsvarende strækning af PEG-tethere. Hvis cadherinoverfladetætheden øges, som foreslået af anmelderen, øges sandsynligheden for samtidige flere Ecad-bindingsbegivenheder, hvilket gør en kvantitativ analyse af sandsynligheden for proteinbinding upålidelig. Af denne grund (sammen med den iboende svaghed i vores dockinganalyse) har vi udelukket proteindockingssimuleringerne fra manuskriptet.
Finalt bruger vi nu i det reviderede manuskript klyngeanalyse til at gruppere de enkelte molekyleafbindingsbegivenheder til dynamisk kraftspektroskopi (DFS). Vi har for nylig vist, at den K-means clustering-algoritme, som vi anvendte, forbedrer i høj grad estimationen af kinetiske parametre i DFS (Yen og Sivasankar, 2018). Følgelig er de levetider, vi nu rapporterer for Ecad/Dsg2, Dsc2/Dsg2 og Dsc2/Dsc2-interaktioner, mere pålidelige.
2) Docking-simuleringerne er interessante, men giver efter min mening svage beviser for den specifikke bindingsgeometri, som forfatterne foreslår. Jeg vil kraftigt anbefale, at forfatterne er mere forsigtige i fortolkningen og præsentationen af disse resultater eller alternativt præsenterer yderligere data, f.eks. EM-billeder, der understøtter eller tilbageviser beregningsresultatet.
Vi er enige med anmelderen i, at protein-dockingdataene er svage. Vi har derfor fjernet disse resultater fra manuskriptet.
3) Desværre er SIM-billederne ikke overbevisende, som de er præsenteret i øjeblikket. Især er det ikke klart, hvad der tæller som et “desmosom” i forfatternes analyse (figur 5B). En mere sofistikeret behandling af kolokalisering ville være nødvendig for at fastslå det punkt, at E-cadherin og desmoplakin kolokaliserer, og at denne kolokalisering aftager som junctions modnes.
I tidligere undersøgelser (Stahley et al., 2016a, 2016b) har vi udnyttet “jernbanesporets” udseende af DP som afsløret ved superopløsningsbilleder til at definere desmosomer ved immunofluorescens (som vist i Figur 3A). Andre på området har også brugt “jernbanespor”-morfologi til at identificere desmosomer i SIM-billeder (se f.eks: Chen et al., (2012); Ungewiß et al., (2017))). Størrelsen og organiseringen af disse strukturer, som afsløret af SIM, er fuldt ud i overensstemmelse med de klassiske EM-definitioner af desmosomer. Vi målte pixelintensiteten for de to cadheriner (Ecad eller Dsg2) inden for disse strukturer ved hjælp af standard billedanalyse. Det er vigtigt, at vi ikke forsøger at påstå samlokalisering. Vi måler snarere rekruttering af cadherin til membrandomæner, der viser DP rail road track farvemønstre. Vi er klar over, at det nogle gange er vanskeligt at skelne jernbanespor på tidlige tidspunkter. Af denne grund var det tidligste tidspunkt, hvor vi mente, at vi kunne identificere bona fine jernbanesporsfarvninger, 1 time. Desuden foretager vi kun målinger på steder, hvor vi kan observere jernbanesporsmønstre, snarere end DP-punkter. Endelig er vores resultat, at Ecad er til stede i spirende desmosomer, i overensstemmelse med klassiske immun-EM-eksperimenter, der viser, at Ecad kan lokaliseres til desmosomer (Jones, 1988). Derfor føler vi os sikre på vores evne til at identificere desmosomer og til at måle relative niveauer af de to cadheriner på forskellige tidspunkter.
4) Jeg overlader dette sidste punkt til redaktørens skøn. Efter min mening fastslår kolokaliseringsdataene, selv om de tages for sande, ikke den funktionelle relevans. Det ville være meget rart at se et knockdown/rekonstitutionsforsøg med L175D E-cadherin. Forudsigelsen er, at dette molekyle aldrig ville kolokalisere med desmoplakin, uanset krydsningsalderen. Overtrædelse af denne forudsigelse ville kaste tvivl om forfatternes foretrukne model.
Baseret på anmelderens forslag har vi nu udført eksperimenter for direkte at teste den rolle, som de forskellige ekstracellulære Ecad-domænemutationer spiller i forhold til at hindre rekruttering af DP og Dsg2 i keratinocytter. Disse data er beskrevet i underafsnittet “Ecad L175 er essentiel for effektiv intercellulær Dsg2 rekruttering og desmosom samling”. De tilsvarende billeder er vist i figur 5 og i figur 5-figurbilag 1. De anvendte metoder er beskrevet i underafsnittet “Isolation, dyrkning, transfektion og konfokal billeddannelse af primære keratinocytter”. Til disse eksperimenter anvendte vi EKO/PKD-muskeratinocytter, som stort set ikke udtrykker klassiske cadheriner. Vi har tidligere vist, at disse EKO/PKD keratinocytter ikke er i stand til at samle AJ’er og desmosomer på grund af tabet af alle klassiske cadheriner (Michels et al., 2009). Disse celler giver os således mulighed for direkte at vurdere Ecad-mutanternes evne til i) at initiere AJ-dannelse og ii) vurdere deres evne til at rekruttere desmosomale komponenter til steder med indledende celle-cellekontaktdannelse.
Da vi var interesseret i at vurdere Ecad-mutanternes evne til at rekruttere desmosomale proteiner tidligt under junction-dannelsen, udtrykte vi enten fuld længde Ecad WT eller mutanter i EKO/PKD keratinocytter og analyserede DP og Dsg2 rekruttering til steder af intercellulære kontakter ved hjælp af konfokal mikroskopi. For at undersøge rekruttering på forskellige stadier af junction dannelse og modning blev keratinocytter fikseret og immunfarvet for DP, Dsg og Ecad på tre tidspunkter efter Ca2+ skiftet (3 timer, 6 timer og 18 timer).
Vores data viste, at 3 timer efter Ca2+ skiftet var 93% af WT-Ecad beriget i lynlåslignende tidlige AJ’er på steder af intercellulære kontakter. I modsætning hertil dannede kun 48% af L175D-Ecad transficerede keratinocytter AJ-zippers, sandsynligvis på grund af nedsat Ecad cis-dimer-dannelse (Figur 5 A, B). På disse tidlige tidspunkter efter Ca2+-skiftet var 66% og 91% af WT-Ecad-lynlås-kontakterne positive for henholdsvis Dsg2 og DP (Figur 5 A, C, D, E). Da cellerne fik lov til at engagere sig i Ca2+-afhængig intercellulær adhæsion i 18 timer, steg de junctionelle lokaliseringer af Ecad-Dsg2 og Ecad-DP til henholdsvis 97 % og 100 % (Figur 5 A, C, D, E). I modsætning hertil viste kun 39% af L175-inducerede lynlås-kontakter Dsg2-rekruttering 3 timer efter skift til høj Ca2+, hvilket steg til 65% ved 18 timer (Figur 5 A, C), hvilket bekræfter, at en direkte interaktion mellem Ecad og Dsg2 er nødvendig for effektiv rekruttering af Dsg2 til tidlige intercellulære kontakter. Tilsvarende var efter 3 timer kun 28 % af L175D-Ecad-mutantens etablerede intercellulære kontakter positive for DP efter 3 timer, hvilket blev øget til 72 % efter 18 timer, hvilket tyder på en kompenserende mekanisme på senere stadier (Figur 5 D, E).
For at bekræfte, at den observerede effekt af L175D-mutationen ikke skyldtes hæmmet AJ-dannelse, transfekterede vi EKO/PKD keratinocytterne med den fulde længde Ecad-K14E mutant, der afskaffer X-dimerdannelse og fanger Ecad i en strand-swap dimer konformation. Vores data viste, at kun 4% af de transficerede kontaktceller dannede lynlåse på tidlige (3 timer) tidspunkter efter skift til høj Ca2+ med kun 24% af de transficerede kontaktceller, der viste lynlåse på sene (18 timer) tidspunkter (Figur 5 A, B, Figur 5-figurtillæg 1), hvilket bekræfter, at K14 er afgørende for effektiv AJ-dannelse og dermed intercellulær kontaktetablering. De få K14E AJ’er, der blev dannet, rekrutterede imidlertid Dsg2 og især DP mere effektivt end L175D (Figur 5 A, C, E, Figur 5-figurtillæg 1). Dette resultat bekræftede, at forsinket rekruttering af Dsg2 til intercellulære kontakter ikke var resultatet af Ecad L175D’s manglende evne til effektivt at danne AJ’er, men snarere på grund af fraværet af direkte interaktion mellem Ecad og Dsg2. Da der aldrig var nogen samlokalisering af DP og Ecad i fravær af lynlåse (Figur 5-figurtillæg 1), tyder dataene også på, at Ecad trans-interaktioner går forud for Ecad/Dsg2-interaktioner. Denne konklusion styrkes yderligere af vores fund, at der ikke blev observeret nogen DP-rekruttering ved ophævelse af Ecad trans-adhæsion, og dermed zippers, ved at transficere Ecad-DM i fuld længde (W2A-K14E dobbeltmutant, Figur 5-figurtillæg 1) i EKO/PKD keratinocytter. Samlet set bekræfter disse resultater, at aminosyre L175 medierer Dsg2-interaktioner og letter tidlig desmosomkompleksdannelse i celler.
Reviewer #2:
1) Fundet af, at E-cadherinrest L175 er kritisk for interaktion med Dsg2, er spændende. Der er imidlertid ikke identificeret nogen interagerende partnerrester. Under denne omstændighed synes forudsigelse af en konformation for E-cadherin/Dsg2-interaktion ved docking usikker; det synes usikkert, at den forudsagte konformation vedrører den sande bundne konformation.
Vi er enige med anmelderen i, at protein docking dataene er spekulative og har derfor fjernet disse resultater fra manuskriptet.
2) Der er kun en tynd forbindelse den foreslåede Dsg2/E-cadherin interaktion til biologien af desmosom samling. Alligevel synes forfatterne at have en klar vej frem. De hævder, at tilstedeværelsen af E-cadherin i spirende desmosomer (vurderet eksperimentelt ved samtidig farvning for desmoplakin i figur 5) er bevis for den rolle, som den Dsg2/E-cadherin-sammenslutning, de har identificeret, spiller. Nu, hvor de har identificeret en mutant, der forhindrer denne association, bør eksperimenterne i figur 5, der er udført med mutanten, føre til andre resultater. Dette eksperiment ville i væsentlig grad tilføje til stringensen af dette papir.
Som beskrevet i svar 4 til anmelder 1 udtrykte vi fuld længde Ecad WT og Ecad mutanter i EKO/PKD keratinocytter og analyserede Dsg2 og DP rekruttering til steder af intercellulære kontakter. Disse resultater bekræfter, at aminosyre L175 medierer Dsg2-interaktioner og letter tidlig desmosomkompleksdannelse i celler. Disse data er beskrevet i underafsnittet “Ecad L175 er afgørende for effektiv intercellulær Dsg2 rekruttering og desmosom samling” i manuskriptet. De tilsvarende billeder er vist i figur 5 og i figur 5-figurbilag 1. De anvendte metoder er beskrevet i underafsnittet “Isolation, kultur, transfektion og konfokal billeddannelse af primære keratinocytter”.
Reviewer #3:
1) Dette manuskript identificerer og karakteriserer et molekylært samspil mellem E-cadherin og Desmoglein 2 ved hjælp af isolerede proteiner og viser øget kolokalisering mellem disse to molekyler i keratinocytter tidligt under desmosomassamlingen. Dette er potentielt meget interessante observationer, der kan forklare, hvordan klassiske cadheriner kontrollerer samlingen af desmosomer. Selv om dette er veldokumenteret af flere grupper i litteraturen, er de underliggende mekanismer stadig for det meste ukendte. Deres konklusion “Our integrated single molecule experiments, protein-protein docking predictions and cell based super resolution imaging show that Ecad/Dsg2 interactions play an important role in early desmosome assembly” angivet i starten af Discussion section er dog en ret kraftig overdrivelse, da interaktionen er baseret på karakterisering på isolerede ekstracellulære domæner og statisk om end højopløsningsmikroskopi. Der er ikke lavet noget eksperiment for at vise, at når man forstyrrer denne interaktion, så forringes desmosomopsamlingen faktisk, hvilket efter min mening ville være det minimale for at gøre dette sæt data virkelig interessant og relevant for et bredt publikum.
Som beskrevet i svar 4 til anmelder 1, har vi nu udtrykt fuld længde Ecad WT, og Ecad mutanter i EKO/PKD keratinocytter og vist, at aminosyre L175 medierer Dsg2 interaktioner og letter tidlig desmosomdannelse i cellerne som vurderet ved DP rekruttering. Disse data er beskrevet i manuskriptets underafsnit “Ecad L175 er afgørende for effektiv intercellulær Dsg2-rekruttering og desmosom-sammensætning”. De tilsvarende billeder er vist i figur 5 og i figur 5-figurbilag 1. De anvendte metoder er beskrevet i underafsnit “Isolation, kultur, transfektion og konfokal billeddannelse af primære keratinocytter”.
2) Også i lyset af, at interaktionen er calciumuafhængig, mens klassisk cadherinafhængig tidlig desmosomsamling kræver tilstedeværelse af calcium (hvilket slet ikke diskuteres).
Vi takker anmelderen for denne indsigtsfulde kommentar. Som beskrevet i underafsnittet “Ecad L175 er afgørende for effektiv intercellulær Dsg2-rekruttering og desmosomsamling”, afslører konfokal billeddannelse af mutant Ecad udtrykt i musekeratocytter nu, at desmosomsamlingen initieres på steder med Ca2+-afhængig Ecad transhomodimerisering. Baseret på vores data foreslår vi en model, hvorefter desmosom samling fremmes både af de direkte cis-interaktioner mellem Ecad og Dsg2 og trans-binding af modsat Ecad. I vores model tjener trans homodimerisering af Ecad fra modsatte celler som et rumligt signal til at koordinere desmosom samling. Ecad danner efterfølgende cis-dimerkomplekser med Dsg2. Når Dsg2 er lokaliseret i det oprindelige desmosom, dissocieres det fra Ecad og binder sig til Dsc2 for at danne modne modne desmosomer. Da Dsc2/Dsg2-komplekset har en længere levetid end både Ecad/Dsg2-komplekset og Dsc2/Dsc2-komplekset, giver dette sandsynligvis mulighed for robust celle-celleadhæsion og gør det muligt for det modne desmosom at modstå mekanisk kraft. Denne model er beskrevet i figur 6 og i afsnittet Diskussion.
3) Da der er tale om en helt ny interaktion med lav affinitet, er det sandsynligvis svært at lave interaktionsassays i forbindelse med celler, hvor den ene celle udtrykker E-cadherin og den anden Dsg2 for at undersøge, om der er nogen interaktion. Men da deres data delvist er baseret på modellering, bør forfatterne også generere en mutant, hvor A125 og A124 er muteret for at give langt bedre beviser for eksistensen af den foreslåede y-dimere.
Da resultaterne af protein docking ikke er robuste, har vi nu elimineret disse data fra manuskriptet. Vores eksperimenter med EKO/PKD keratinocytter, der viser, at mutation af aminosyre L175 på Ecad forringer rekruttering af Dgs2 og især DP til steder med tidlig kontaktdannelse, viser imidlertid, at Ecad-L175 letter desmosomdannelse i celler, bekræfter vores biofysiske resultater.
Summary:
Revisorerne mener, at selv om de biofysiske data er overbevisende, er der behov for en mere stringent kvantitativ analyse for at understøtte de konklusioner, der drages af dataene i figur 3 og 5. I princippet kan disse bekymringer løses med yderligere dataanalyse i stedet for eksperimenter, og i dette tilfælde vil vi overveje et revideret manuskript.
Vi takker redaktøren for denne opmuntrende anmeldelse. Som beskrevet nedenfor adresserer vores reviderede manuskript alle de fremhævede spørgsmål.
1) Konklusionen om, at E-cadherin-Dsg-interaktion er nødvendig for den indledende desmosomdannelse, er baseret på kolokalisering af Dsg og E-cadherin, der aftager som krydset modnes. I figur 3 er det imidlertid ikke klart, om den observerede kolokalisering med DP er signifikant ud over det, der forventes tilfældigt, eller om den skyldes tidsafhængige ændringer i E-cadherin subcellulær lokalisering, der ikke er relateret til krydsningsmodning. I figur 3C fremhæver kontrolforsøg vist i det højre panel kolokalisering af Dsg2 og DP – kendte Desmosom-komponenter – og viser en tæt overensstemmelse i fluorescenssignalerne på alle tre tidspunkter. I modsætning hertil synes ekspressionen af E-cadherin og DP i de venstre paneler at overlappe til en vis grad, men de viser ikke den korrespondance i signalerne, der er observeret for kontroleksperimenterne. Svaret på de oprindelige gennemgangspunkter om dette emne (f.eks. anmelder 1, punkt 3) fokuserer på at definere et desmosom, men behandler ikke ovenstående punkt.
Vi vil gerne præcisere, at vi ikke måler samlokalisering, men i stedet rekruttering af enten Ecad eller Dsg2 til regioner af membranen, der viser et DP ‘jernbanespor’-mønster. For at gøre dette klarere har vi nu ændret det reviderede manuskript for at understrege, at Ecad er ‘beriget i spirende desmosomer’ snarere end at være ‘udelukket fra modne desmosomer’.
For direkte at imødekomme anmeldernes bekymringer vedrørende vores måling af Ecad-berigelse i desmosomer, viser vi nu, at de relative niveauer af Ecad langs hele cellegrænsen (Ecad:DP-forholdet ved cellegrænser) forbliver uændret over tid. Disse data bekræfter, at Ecad-berigelsen inden for DP-jernbanespor på tidlige tidspunkter er specifik for desmosomale regioner af membranen og er signifikant ud over det, der forventes ved tilfældig tilfældighed eller på grund af ændringer i E-cadherin-lokalisering, der ikke er relateret til krydsningsmodning. Dataene er vist i figur 3-figurtillæg 1 og er beskrevet i underafsnittet “Ecad er til stede i nascent desmosomer, men ikke i modne desmosomer”.
Endeligt, da de linjescanninger, der er vist i figur 3, var forvirrende, har vi elimineret linjescanningerne fra det reviderede manuskript. I stedet viser vi nu i figur 3B flere repræsentative billeder af desmosomale regioner i humane keratinocytter, der er dyrket i medier med høj Ca2+ i 1, 3 eller 18 timer. Disse resultater understreger det vigtigste “take-away”-budskab i figur 3C: Ecad-niveauer er beriget i spirende desmosomer, med relative niveauer, der falder, når desmosomer modnes.
2) Lignende bekymringer blev rejst vedrørende Figur 5, som formodes at vise, at Ecad L175 er afgørende for effektiv intercellulær Dsg2-rekruttering og desmosomsamling. Billederne i panel A viser faktisk en dramatisk forskel i Dsg2- og DP-lokalisering i forhold til WT- eller mutantcadherin. Mens Dsg2 og DP samlokaliseres med WT eller K14E Ecad ved krydsninger, forbliver de i separate punkter, der flankerer L175D Ecad-krydsningen, og samlokaliseres ikke med den. Det er imidlertid ikke klart, hvad forfatterne kvantificerede for at teste betydningen af denne fænotype. I B, hvad er “% af krydset, der danner kontakter”? Hvordan er en kontakt defineret? Hvilke krydsninger måler de? AJ eller desmosomer? I C og E, hvad mener de med % af Dsg2- eller DP-positive junctions? Hvordan blev junctions defineret?
Vi har nu tilføjet et figurpanel (Figur 5-figurtillæg 1A) for at illustrere de kvantificeringskriterier og junctional kategorier, der blev anvendt i vores analyse. Dette panel viser eksempler på celler, der er transficeret med Ecad-mutant, som ikke (venstre panel) eller (højre panel) viser intercellulær AJ-dannelse. For Dsg2- eller DP-rekruttering kvantificerede vi kun de intercellulære grænseflader, hvor der blev observeret AJ-lynlåse. I indsætningerne i figurpanelet viser vi eksempler på AJ-positive kontakter, der enten er positive for DP eller negative for DP.
I underafsnittet “Ecad L175 er afgørende for effektiv intercellulær Dsg2-rekruttering og desmosom-samling” i manuskriptet angiver vi nu, at transficerede keratinocytternes evne til at danne AJ’er først blev vurderet ved dannelse af “lynlåslignende” mønstre af Ecad ved intercellulære kontakter. Vi har tidligere vist, at disse lynlåse repræsenterer tidlige AJ’er og rekrutterer AJ-markørproteiner som vinculin (Rübsam et al., 2017). Vi undersøgte kun intercellulære grænseflader med AJ-zippers, for deres evne til at rekruttere Dsg2 og DP til disse kontakter. Det er vigtigt, at vi aldrig har observeret nogen berigelse af desmosomale komponenter ved intercellulære kontakter i fravær af AJ-lynlåse (Michels et al., 2009).
Som beskrevet i svar 3a nedenfor diskuterer vi nu i afsnittet Diskussion, at selv om Dsg2 og DP viser en vis samlokalisering ved Ecad-positive lynlåse inden for 3 timer, er der også ikke-overlappende junctional farvning, hvilket tyder på, at AJ’er og desmosomer allerede er begyndt at segregere i særskilte intercellulære junktioner. Vi kvantificerede ikke denne samlokalisering i vores manuskript, da hovedpointen med vores eksperimenter var at vise L175’s relevans for rekruttering af Dsg2 til intercellulære grænseflader og lette desmosomdannelsen (som illustreret af DP-rekruttering til intercellulære kontakter). Vi mener, at forsinkelsen i rekruttering mellem WT, L175-mutant og K14-mutant, som er kvantificeret i figur 5, illustrerer dette punkt.
3) Der er også ændringer til introduktions- og diskussionsafsnittet, der er nødvendige for at tage fat på ovenstående punkter samt tilgængeligheden af papiret:
a) Relateret til være punkter ovenfor, synes forbindelsen mellem in vitro-bindingseksperimenter og den foreslåede biologiske rolle tynd baseret på lokaliseringsundersøgelser, der afslører overlappende, men ikke virkelig samlokaliserede farvningsmønstre. Forfatterne skal forklare dette fund; måske er samlokalisering dynamisk, og/eller kun en delmængde af E-cadherinmolekyler er bundet til Dsg2. Dette punkt skal i det mindste diskuteres for at rationalisere resultaterne af lokaliseringseksperimenterne med den foreslåede model.
På grund af den forbigående karakter af Ecad/Dsg2-interaktioner forventes desmosomale proteiner, der rekrutteres til krydsninger, hurtigt at adskille sig fra Ecad. Følgelig forventes billeder af intercellulære grænseflader at have både overlappende og separate Ecad- og desmosomale proteinfarvningsmønstre. I overensstemmelse hermed, selv om Dsg2 og DP viser en vis samlokalisering ved Ecad-positive lynlåse (Figur 5), observeres der en betydelig ikke-overlappende krydsningsfarvning, selv inden for de første 3 timer. Dette tyder på, at AJ’er og desmosomer hurtigt adskiller sig i særskilte intercellulære junctions. Vi anfører nu dette i afsnittet Diskussion.
b) I begyndelsen af af afsnittet Diskussion hævder forfatterne, at de: “identificere to kritiske begivenheder, der initierer og fremmer effektiv desmosom samling: (i) stabil trans homodimerisering af Ecad og (ii) den direkte heterofile binding af Ecad og Dsg2 ektodomæner. Vores data viser, at desmosom samling initieres på steder med Ecad trans homodimerisering. Efterfølgende binder Ecad og Dsg2 via en bevaret Leu 175 på Ecad cis-bindingsgrænsefladen og danner kortvarige heterofile komplekser, der lokaliseres til tidlige desmosomer og effektivt rekrutterer desmosomale proteiner til steder, hvor der dannes intercellulær kontakt. Efterhånden som desmosomer modnes, dissocieres Dsg2 fra Ecad og danner stabile bindinger med Dsc2 for at formidle robust adhæsion.” – Dette afsnit blander observationer, fortolkning og hypotetiske modeller og er som sådan misvisende. De bør adskille resuméet af resultater fra fortolkning og deres model.
Som foreslået af anmelderne har vi fjernet fortolkningerne fra det første afsnit i afsnittet Diskussion og opsummerer nu kun resultaterne.
c) Forfatterne skriver i Abstract og Introduktion “Ecad interagerer med Dsg2 via en konserveret Leu 175 på Ecad cis-bindingsgrænsefladen.” – Forfatterne bør ikke antage, at læserne er bekendt med E-cad homofile interaktioner og bør forklare dette eksplicit.
I Abstractet står der nu: “Tidligere undersøgelser viser, at E-cadherin (Ecad), et adhæsivt protein, der interagerer i både trans- og cis-konformationer, letter desmosomassamlingen via en ukendt mekanisme”.
Dertil kommer, at der i Introduktionen nu står: “E-cadherin (Ecad), et adhæsivt protein, der interagerer i både trans- og cis-konformationer, letter desmosomassamlingen via en ukendt mekanisme: ‘Da Ecad interagerer lateralt for at danne cis-dimere på den samme celleoverflade (Harrison et al., 2011), mens Ecad-molekyler fra modsatte celler interagerer i en trans-streng-swap dimer konformation (Boggon et al., 2002; Parisini et al, 2007; Vendome et al., 2011) og en trans X-dimer konformation (Ciatto et al., 2010; Harrison et al., 2010), brugte vi mutanter, der specifikt ophæver enten Ecad trans- eller cis-interaktioner, og testede deres binding til enten Dsg2 eller Dsc2’. Endelig anfører vi nu i indledningen, at “Tidligere strukturelle undersøgelser har vist, at L175 medierer homofil Ecad cis dimerisering (Harrison et al., 2011)”.
https://doi.org/10.7554/eLife.37629.013