Udvikling af toksigene Vibrio cholerae og etablering af reservoirer i akvatiske økosystemer
Resultater
Fire departementer – Artibonite, Centre, Nord-Ouest og Ouest – tegner sig for 90 % af de rapporterede koleratilfælde i Haiti (9). Vi fokuserede vores indsats på Ouest-departementet (Fig. 1A), en kystregion, der er rig på akvatiske økosystemer, hvor vi har isoleret toksigene V. cholerae O1 fra faste flod- og flodmundingssteder (Fig. 1A). Forekomsten af toksigene akvatiske V. cholerae O1 korrelerede med øget temperatur og nedbør, men ikke med antallet af fækale colibakterier, hvilket tyder på, at forekomsten ikke alene skyldtes fækal forurening (10). Det månedlige antal tilfælde i Ouest, der svingede årligt, men faldt i den tørre sæson og steg i regntiden (april til oktober), korrelerede med øget temperatur og nedbør (fig. 1B). Dette er i overensstemmelse med mønstre for endemisk V. cholerae O1 i Bangladesh og Peru, hvor sæsonbestemte koleraudbrud korrelerer med øget V. cholerae O1 i miljøet og stigninger i vandtemperatur eller nedbør (11, 12).
For at skelne mellem evolution under selektivt pres (tilpasning) eller genetisk drift beregnede vi forholdet mellem nonsynonyme (dN) og synonyme substitutionsrater (dS) (dN/dS) (SI Appendix, Fig. S6 og Tabel S5). Den evolutionære dynamik i de kliniske isolater var hovedsagelig drevet af rensende selektion (dN/dS = 0,6, P < 0,001), hvilket er i overensstemmelse med en negativ Tajima’s D (-2,3, P < 0,005) og en population, der oplever flaskehalse og/eller selektive fejninger. Negativ selektion forventes at drive den allerede etablerede epidemi hos mennesker, der har nået et højdepunkt i det adaptive landskab i løbet af en tidlig epidemisk fase drevet af diversificerende selektion (14). I modsætning hertil viste miljøisolater større nonsynonyme hastigheder (dN/dS = 2,1, P < 0,001), hvilket er karakteristisk for en heterogen mikrobiel population, der for nylig blev introduceret til et nyt miljø og undergår fiksering af ny variantdrevet diversificerende selektion. Faktisk fandt vi miljøspecifikke molekylære aftryk i genomerne af V. cholerae, der med succes replikerede og persisterede i det akvatiske miljø. I alt syv nonsynonyme mutationer i kodningsregioner, der potentielt giver en selektiv fordel til miljøpopulationen af V. cholerae, opstod langs rygsøjlen i fylogenien af miljøisolater mellem 2012 og 2015 (Fig. 3 og SI Appendix, Tabel S7). Tre miljøspecifikke mutationer, to tidligt i rygmarvsforgreningen (Fig. 3) og en i en intern gren (SI Appendix, Tabel S7), påvirkede gener i type II-sekretionssystemet (TSSII): generelle sekretionsvejsproteiner A og G samt K (SI Appendix, Tabel S7). TSSII spiller en central rolle for virulens og overlevelse af V. cholerae i forskellige nicher, såsom vandreservoirer eller menneskelige værter (26). Andre mutationer, der blev fundet langs interne grene, påvirkede gener relateret til miljømæssig stressrespons, kemotaksi/motilitet hos V. cholerae som respons på fluktuerende miljømæssige signaler, kontrol af flagellens kroglængde, biofilmdannelse i det ekstraintestinale miljø og eksponentiel vækst som respons på tilgængelige næringsstoffer (SI Appendix, Fig. S7 og Tabel S7). Miljøisolater, der bidrog med succes til den udviklende miljømæssige slægt, blev ikke kun indsamlet i nærheden af hospitaler og kolerabehandlingscentre i Gressier, men også i de nærliggende Goave- og Carrefour-regioner (Fig. 3).
Evolution og tilpasning af V. cholerae i haitianske vandreservoirer. Fylogenetisk slægtskab og geografisk fordeling af 27 miljøisolater indsamlet mellem 2012 og 2015 i Haiti. Nonsynonyme mutationer, der er erhvervet under udviklingen af miljøpopulationen, rekonstrueret ved Bayesiansk inferens af forfædres tilstand, er angivet langs træets rygsøjle. De SNP’er, der blev påvist langs træets stamme (overlevende slægt), blev sekventielt nummereret fra 1 til 7 for at lette sammenligningen med de yderligere oplysninger, der er rapporteret i SI Appendix, Table S7. Kort viser prøvetagningsstederne, grupperet efter akvatisk kilde, mærket med gule, røde, orange og cyanfarvede prikker i Gressier-regionen, lilla for Carrefour og blå i Jacmel-regionen.
Beviserne for epidemiologiske og miljømæssige evolutionære kræfter, der driver den haitianske epidemi, motiverede os til at overveje en dynamisk model for kolera-sporing af transmission og populationsgenetik gennem akvatiske miljøer og værter. Som i tidligere modeller af kolera fra vores gruppe (27) er vores underliggende epidemiologiske model baseret på SIRW-rammen (susceptible-infected-recovered with reservoir), en udvidelse af den klassiske SIR-ramme (susceptible-infected-recovered) med et tilføjet rum for patogenkoncentration i et akvatisk reservoir (W) (Fig. 4 og SI Appendix, Fig. S8 og S9). I overensstemmelse med Kirpich et al. (27) tillod vi replikation uden for værten sammen med sæsonafhængighed i miljøtransmission, udskillelse og nedbrydning, som antydet af den signifikante korrelation i antallet af tilfælde med nedbør. Ud over denne epidemiologiske formulering tog vi også højde for en evolutionær komponent i vores model. Der tages højde for både neutral drift og selektionspres i vores multilocus-ramme, hvor vi måler Ne ved at beregne den genetiske diversitet og anvende koalescentmetoder (SI Appendix, Text). I overensstemmelse med andre undersøgelser antog vi en afvejning mellem miljømæssig overlevelsesevne og fitness i værtsoverførsel for loci under udvælgelse. Resultaterne fra modelsimuleringer genskaber kvalitative træk ved Ne og månedlige tilfældestællinger (Fig. 4A og SI Appendix, Fig. S8).
Model med blandet overførsel af kolera og forudsigelse af vaccination. (A) Ne (effektiv populationsstørrelse) observeret ud fra data (grå) og i simulering med miljøreplikation (grøn) og Ne i simulering uden miljøreplikation (violet). (B) Forskellige scenarier for vaccination og kontrol for modelsimuleringen med miljøreplikation, navnlig vaccinationsdækning på 64 % (rate på 0,01 d-1), 88 % (rate på 0,04 d-1) og 64 % med en stigning på 10 % i den miljømæssige forfaldshastighed. Her definerer vi vaccinationsdækning som den procentvise reduktion i antallet af modtagelige individer (efter at have nået en tilnærmelsesvis stabil tilstand efter 2 til 3 måneders vaccination). I modsætning til Kirpich et al. (27) og simuleringer uden miljømæssig replikation (SI Appendix, Fig. S10), hvor 64 % vaccinationsdækning udrydder patogenet inden for et år, er det her nødvendigt med enten mere vaccination (88 % dækning) eller øget miljømæssigt forfald (10 % stigning) for at kontrollere kolera i tilstedeværelsen af miljømæssig replikation.
Først viser både modeloutput og data en stigning og et fald i Ne i begyndelsen, hvilket afspejler en hurtig ekspansion efterfulgt af negativ selektion efter det første udbrud (Fig. 4A). Derefter blev der observeret en anden vækst i Ne i 2013, der var større i omfang end forventet alene på grund af værtsoverførsel, og som skyldtes en forudgående sæsonbestemt opblussen, og som strækker sig ind i en periode med faldende forekomst. Vores hypotese om diversificering inden for det akvatiske reservoir giver en forklaring på denne relative stigning i Ne og understøttes af rimelige modelsimuleringer, hvor inddragelse af miljøreplikation giver mulighed for denne evolutionære udforskning i modsætning til tilfælde uden miljøreplikation (Fig. 4A og SI Appendix, Fig. S8). Navnlig blev uuSNP’er i løbet af toppen fra slutningen af 2012 til midten af 2013 påvist i følgende gener i den overlevende miljømæssige slægt: Vch1786_I0012 (1 C→T), Vch1786_I0051-genet (3 C→T), Vch1786_I0998 (30 G→A), Vch1786_I1539 (44 A→G), rseA (52 G→A), epsG (61 A→C) og Vch1786_II0794 (107 C→A) (SI Appendix, Fig. S3). Mutationer i disse gener kan have bidraget til øget tilpasning af miljøstammer i det akvatiske økosystem, selv om fremtidige in vitro-undersøgelser vil være nødvendige for at undersøge deres bidrag til V. cholerae-fitness. Toppen i den miljømæssige replikation efterfølges af et betydeligt fald i Ne, der begynder før den store stilstandsperiode i 2014. Igen forklarer tilfældeforekomsten ikke fuldt ud omfanget af dette fald. Mens flaskehalsen i populationen medfører et fald i Ne, tyder simuleringer på, at den miljømæssige replikation er nødvendig for at fremskynde fiksering af gener, der er tilpasset til at overleve i vandreservoiret. I slutningen af 2014 overføres miljøreservoirerne til værterne med en stigning i antallet af kliniske tilfælde, muligvis forstærket af en gavnlig værtstilpasning og/eller tab af immunitet i værtspopulationen. Omfattende simuleringer, der er kalibreret i forhold til dataene om tilfælde, tyder på, at miljøreplikation bør medtages i modellen for yderligere at passe til den observerede Ne. En vigtig konsekvens af vores resultater er, at replikation og tilpasning i det akvatiske reservoir kan gøre bekæmpelsesstrategier, der er rettet mod værtsoverførsel, mere vanskelige. Ved at projicere fremad fra 2015 i simuleringer observerede vi faktisk, at vaccination let kan fjerne patogenet i fravær af miljøreplikation (SI Appendix, Fig. S10). Men for miljømæssig tilpasning og replikation i overensstemmelse med den observerede Ne er det nødvendigt at vaccinere en meget større del af befolkningen eller tilføje en intervention, der påvirker det akvatiske reservoir, for at eliminere kolera i vores dynamiske model med blandet overførsel (Fig. 4B).