Die genetische Variation verschiedener Entwicklungsstadien von Schistosoma japonicum: begünstigen die Verteilung in Schnecken und die Paarungspräferenz die Übertragung?
Probensammlung
Die Probensammlung und der Versuchsplan sind in Abb. 1 zusammengefasst. Die Schritte der Probensammlung werden im Folgenden beschrieben, einschließlich der Sammlung von Schnecken, der Sammlung von Zerkarien, der Infektion von Mäusen und der Sammlung von adulten Würmern sowie der Sammlung von Miracidien.
Flussdiagramm der Probensammlung und des Versuchsplans
Schneckensammlung
Oncomelania hupensis Schnecken wurden im März und September 2016 aus dem östlichen Bereich des Dongting-Sees (29° 32′ 5.25″ N, 112° 52′ 35.00″ E), Provinz Hunan, China. Die Schnecken wurden in Gräben in 3 Dörfern in einer Entfernung von 10 km gefunden. Bei der Sammelstelle handelt es sich um ein Sumpfgebiet und nicht um einen Nationalpark oder ein anderes Schutzgebiet oder um Privatland. Die Sammlungen wurden mit Genehmigung und Unterstützung des Instituts für Bilharziosebekämpfung der Provinz Hunan, China, durchgeführt, das die Schneckenbekämpfung in diesem Gebiet überwacht. Oncomelania hupensis ist keine gefährdete oder geschützte Art. Die im März gesammelten Schnecken wurden ins Labor zurückgebracht und als Gruppe A und die im September gesammelten als Gruppe B eingestuft. Nach einem Monat Gefangenschaft wurden die Schnecken gewaschen und für 3 Stunden bei 25 °C unter Licht in einzelne mit Wasser gefüllte Gefäße überführt, um das Auftreten von Zerkarien zur Identifizierung der S. japonicum-Infektion zu stimulieren. Schließlich wurden 20 Schnecken aus Gruppe A und 25 Schnecken aus Gruppe B als mit S. japonicum infiziert identifiziert.
Zerkarienentnahme
Nachdem die Zerkarien aus den einzelnen Schnecken freigesetzt worden waren, wurden einige von ihnen mit einer Schlinge in eine Schale überführt und unter dem Mikroskop in einer Zerkarienwaschlösung (5 g/l Lactalbuminhydrolysat, 6,8 g/l NaCl, 0,4 g/l KCL, 0,2 g/l CaCl2, 0,2 g/l MgSO4-7H2O und 1 g/l Glucose) gewaschen. Nach drei Waschvorgängen wurden die Zerkarien einzeln mit 2 μl sterilisierter Waschlösung auf eine Whatman™ FTA-Karte (GE Healthcare, Pittsburgh, USA) pipettiert. Nach dem Trocknen wurden die Karten in einem versiegelten Plastikbeutel in einem Exsikkator bei Raumtemperatur gelagert. Mindestens 50 Zerkarien pro Schnecke wurden einzeln gesammelt und auf Whatman™ FTA-Karten aufbewahrt.
Infektion von Mäusen mit Zerkarien von einzelnen Schnecken
Um mit S. japonicum infizierte Schnecken zu unterscheiden, wurden 2 Kunming-Labormäuse perkutan mit 30 Zerkarien von jeder Schnecke pro Maus infiziert. Insgesamt wurden 40 Mäuse für 20 Schnecken der Gruppe A und 50 Mäuse für 25 Schnecken der Gruppe B infiziert. Die Würmer wurden aus den Mesenterialvenen jeder Maus durch Perfusion mit 0,9 % NaCl gewonnen und 7 Wochen nach der Infektion seziert. Es wurde darauf geachtet, dass die Gefahr der Spaltung von Paaren erwachsener Würmer durch mechanische Einwirkungen während der Perfusion und der Sektion so gering wie möglich gehalten wurde, indem drei erfahrene Techniker eingesetzt wurden, um die Würmer so schnell wie möglich zu verarbeiten. Jedes Wurm-Paar wurde zum Waschen und Markieren sofort in separate Röhrchen überführt und nach der spontanen Trennung paarweise in absolutem Ethanol aufbewahrt. Unpaarige Würmer jeder Maus wurden unter dem Mikroskop untersucht, um das Geschlecht zu bestätigen, und dann in Ethanol aufbewahrt.
Infektion der Mäuse mit Zerkarien, die von allen Schnecken gepoolt wurden (Methode I und II), und Sammlung erwachsener Würmer
Für nachfolgende Infektionen blieben 17 der 20 Schnecken aus Gruppe A und 16 der 25 aus Gruppe B am Leben und in der Lage, ausreichend Zerkarien zu produzieren. Für die beiden Schneckengruppen wurden zwei verschiedene Zerkarien-Pooling-Methoden angewandt. Für die 17 verbleibenden Schnecken der Gruppe A wurden alle Schnecken in einem Kolben mit Wasser zusammengeführt, um das Auftauchen der Zerkarien zu stimulieren (Methode I). Einunddreißig Mäuse wurden dann perkutan mit 34 Zerkarien pro Maus infiziert. Für die Infektion mit 16 Schnecken der Gruppe B wurden 2 Zerkarien von jeder einzeln ausscheidenden Schnecke gepoolt, und die gemischten 32 Zerkarien wurden verwendet, um eine Maus zu infizieren (Methode II), so dass insgesamt 22 Mäuse infiziert wurden. Alle Mäuse wurden geopfert, um 7 Wochen nach der Infektion S. japonicum-Würmer zu sammeln, wie oben beschrieben. Schließlich wurden 530 Würmer von Mäusen nach Methode I (Gruppe A) und 484 Würmer von Mäusen nach Methode II (Gruppe B) gesammelt.
Mirazidiensammlung
Bevor alle infizierten Mäuse zum Sammeln von adulten Würmern geopfert wurden, wurde von jeder Maus 7 Tage lang Stuhl gesammelt, um die über den Darm ausgeschiedenen Eier für das Schlüpfen der Mirazidien zu konzentrieren. Das Eiersediment jeder Maus wurde in einer Flasche mit entchlortem Wasser unter Licht bei 25 °C ausgesetzt, um die Miracidien auszuschlüpfen. Die Miracidien wurden mit einer Pipette aus dem oberen Wasser jedes Kolbens geerntet und in eine Schale mit Miracidien-Waschlösung (5 g/l Lactalbuminhydrolysat, 6,5 g/l NaCl, 0,14 g/l KCl, 0,12 g/l CaCl2 und 0,20 g/l NaHCO3) überführt. Nach drei Waschvorgängen wurden die Miracidien einzeln mit 2 μl sterilisierter Waschlösung auf eine Whatman™ FTA-Karte pipettiert. Nach dem Trocknen wurde die Karte in einem versiegelten Plastikbeutel in einem Exsikkator bei Raumtemperatur gelagert. Es wurden mindestens 50 Miracidien pro Mäusehocker gesammelt.
Miracidien, die aus Eiern geschlüpft waren, die in den Lebern infizierter Mäuse gefangen waren, wurden ebenfalls wie folgt gesammelt. Die Leber jeder infizierten Maus wurde nach dem Sammeln der adulten Würmer entnommen, in kaltem 1,2 %igem NaCl homogenisiert und filtriert, um das Eiersediment zu erhalten. Die Miracidien wurden nach der gleichen Methode wie bei der Stuhlprobe ausgebrütet. Schließlich wurden mindestens 50 Mirazidien pro Mausleber einzeln pipettiert und auf Whatman™ FTA-Karten gespeichert.
Genomische DNA-Extraktion
Für die DNA einer einzelnen Zerkarien- oder Mirazidienprobe wurde eine Scheibe mit 2 mm Durchmesser aus der Mitte jedes Probenpipettierbereichs einer Whatman™ FTA-Karte mit einem 2 mm Harris Micro-punch (GE Healthcare Life Sciences, Stevenage, UK) entnommen. Das Plättchen wurde in den Boden einer 96 Well, 1,2 ml U-Boden-Platte gelegt. Nach einmaligem Waschen mit 100 μl FTA-Reinigungsreagenz (GE Healthcare Life Sciences) für 5 Minuten, gefolgt von 100 μl TE-Puffer (10 mM Tris-Cl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0), wurden 14 µ 0,1 M NaOH mit 0,3 mM EDTA, pH 13,0, in jede Vertiefung gegeben und die Lösung 5 Minuten lang inkubiert, woraufhin 26 µl 0,1 M Tris-HCl-Puffer, pH 7,0, hinzugefügt wurden. Dann wurde die Platte durch dreimaliges Schütteln mit einem Vortex-Mixer für jeweils etwa 10 Sekunden gemischt. Die Lösung wurde dann 10 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen gelassen, 10 Mal gepusht, und das Eluat wurde in eine saubere 96-Well-Platte überführt und für die weitere Verwendung bei – 20 °C gelagert.
Wie bei den einzelnen adulten Würmern wurde der vordere Teil, einschließlich des Uterus, unter dem Mikroskop von jedem adulten weiblichen Wurm abgeschnitten, um den Einfluss der Eier im Uterus auf den Genotyp des weiblichen Wurms zu vermeiden. Für die DNA-Extraktion wurden die ganzen männlichen oder unreifen weiblichen Würmer verwendet. Die gesamte genomische DNA wurde aus jedem Wurm einzeln mit einem Standard-Natriumdodecylsulfat-Proteinase-K-Verfahren wie folgt extrahiert. Jeder Wurm wurde in 400 μl Extraktionspuffer, der 50 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1 % SDS und 100 mg/ml Proteinase K enthielt, bei 56 °C für 1 Stunde unter vorsichtigem Mischen inkubiert und aufgetaut. Die DNA in der Lösung wurde mit einer Standard-Phenol/Chloroform-Reinigung extrahiert, gefolgt von 3 M Natriumacetat (pH 5,2) und Ethanol-Fällung. Die DNA-Pellets wurden in 70 %igem Ethanol gewaschen, an der Luft getrocknet und in 20 μl TE (pH 8,0) resuspendiert und bei – 20 °C als roher DNA-Extrakt des adulten Wurms zur weiteren Verwendung gelagert.
PCR-Amplifikation und Mikrosatelliten-Genotypisierung
Um zu bestätigen, dass genomische DNA in der Elution der FTA-Karte oder im Rohextrakt der in Ethanol gelagerten Probe vorhanden war, wurde das 28S ribosomale DNA-Genfragment aus der DNA-Lösung einer einzelnen Zerkarie, eines Miracidiums oder eines adulten Wurms mit den folgenden Primern amplifiziert: Vorwärts (5′-GTG GAG TTG AAC TGC AAG C-3′) und Rückwärts (5′-GCT CAA CAW TAA TAG TCA AAC CTG-3′). Die PCRs wurden mit den Illustra PuReTaq Ready-To-Go PCR Beads in einer 96-Well-Platte (GE Healthcare Life Sciences, USA) durchgeführt. Für jedes Bead wurden 2 µl FTA-Elution von einer einzelnen Larve oder 0,5 µl Rohextrakt von einem einzelnen Wurm zusammen mit 1 µl jedes Primers und Wasser zu einem Endvolumen von 25 µl hinzugefügt. Die Amplifikation wurde mit dem folgenden Programm durchgeführt: 95 °C für 5 min; gefolgt von 40 Zyklen von 30 s bei 95 °C, 30 s bei 60 °C und 40 s bei 72 °C; und einem abschließenden Verlängerungsschritt bei 72 °C für 7 min. Die Reaktionen wurden dann mit 5 µl auf einem 2%igen Agarose-TAE-Gel überprüft.
Eine Genotypisierung im kleinen Maßstab wurde für 30 Zerkarien, 30 Miracidien und 30 Würmer durchgeführt, die zufällig ausgewählt wurden, um ein optimales Multiplex-Mikrosatelliten-Loci-Panel für die PCR-Amplifikation zu erstellen. Zwanzig Loci, die in früheren Studien und in unserem Labor entwickelt und validiert wurden, wurden überprüft. Schließlich wurden 9 Mikrosatellitenloci (Additional file 1: Tabelle S1) ausgewählt, um das Panel zu bilden. Die Mikrosatelliten-Loci jeder DNA-Probe wurden mit dem Type-it Microsatellite PCR-Kit (Qiagen, Manchester, UK) mit dem Multiplex der 9 Loci genotypisiert. Der Vorwärtsprimer jedes Paares wurde mit einem geeigneten Fluoreszenzfarbstoff markiert, darunter 6-FAM, HEX, TAMRA und ROX (Zusätzliche Datei 1: Tabelle S1). PCR-Reaktionen wurden in einer 96-Well-PCR-Platte unter Verwendung von 6,25 µl 2× Master-Mix, 1,25 μl Q-Lösung, 0,5 μl Primer (10 μM), 2 μl DNA-Vorlage und 2,5 μl ddH2O vorbereitet und dann in einem Bio-Rad-Thermocycler mit dem folgenden Programm durchgeführt: 95 °C für 5 min; gefolgt von 35 Zyklen von 30 s bei 95 °C, 90 s bei 60 °C und 3 min bei 72 °C; gefolgt von einem abschließenden Verlängerungsschritt bei 60 °C für 45 min. Die PCR-Reaktionen wurden überprüft, indem 5 µl auf ein 2%iges TAE-Agarosegel gegeben wurden. Erfolgreiche Amplifikationen wurden an Sangon Biotech (Shanghai, China) zur Fragmentanalyse auf einem ABI3100 Genanalysegerät (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) geschickt. Die Genotypen wurden mit einem Mikrosatelliten-Plugin von Geneious 11.0 ausgewertet. Alle Proben wurden zweimal amplifiziert und genotypisiert, um die Abweichung zu verringern. Insgesamt wurden Genotypen von 346 Zerkarien, 701 adulten Würmern und 393 Miracidien für die folgenden Analysen generiert.
Analysen der genetischen Vielfalt
Die genetische Vielfalt jedes Locus wurde in allen genotypisierten Zerkarien durch Berechnung der beobachteten Anzahl von Allelen (Na), der effektiven Anzahl von Allelen (Ae) in GenAlEx 6.5 und des Allelreichtums (Ar) und der Gendiversität (Hs) in hierfstat ver. 0.04-22 , einschließlich 156 Zerkarien von 20 Schnecken der Gruppe A und 190 Zerkarien von 25 Schnecken der Gruppe B. Die Abweichung vom Hardy-Weinberg-Gleichgewicht (HWE) für jeden Locus wurde mit dem Chi-Quadrat-Test in GenAlEx getestet, und der Test des Kopplungsungleichgewichts zwischen den Loci wurde in SHEsis berechnet.
Die Na, Ae, Ar und Hs wurden für verschiedene Populationen während des Prozesses der Mäuseinfektion wie folgt berechnet. Für die bei der Infektion verwendeten Zerkarienpopulationen wurden 132 Zerkarien aus 17 Schnecken der Gruppe A (verwendet in Methode I) und 122 Zerkarien aus 16 Schnecken der Gruppe B (verwendet in Methode II) ausgewertet. Nach der Genotypisierung und dem Herausfiltern von Daten geringer Qualität wurden mindestens 5 Paare erwachsener Würmer (sofern vorhanden) und alle unpaaren Würmer von jeder Maus erfolgreich genotypisiert. Insgesamt wurden 357 Würmer von Mäusen in Methode I (unter Verwendung von Zerkarien aus 17 gepoolten Schnecken der Gruppe A) und 344 Würmer von Mäusen in Methode II (unter Verwendung gleichmäßig gemischter Zerkarien aus 16 einzelnen Schnecken der Gruppe B) einbezogen. Zusätzlich wurde die genetische Vielfalt der adulten Würmer in jeder Maus geschätzt, um die allelische Konsistenz der adulten Würmer unter den Mäusen in Methode I und II separat zu überprüfen. Für die Miracidium-Populationen wurde die genetische Diversität der Miracidien aus Leber und Stuhl auf populationsübergreifender Ebene berechnet (Miracidien aus Leber oder Stuhl aller Mäuse), da nur 3-4 Miracidien aus Leber oder Stuhl jeder Maus genotypisiert wurden, einschließlich 93 Miracidien aus Leber (3 pro Maus) und 124 Miracidien aus Stuhl (4 pro Maus) in Methode I und 88 Miracidien sowohl aus Leber als auch aus Stuhl (4 pro Maus getrennt) in Methode II.
Analyse der molekularen Varianz (AMOVA)
Die genetische Differenzierung aller genotypisierten Zerkarien aus Gruppe A und Gruppe B wurde mittels AMOVA in Arlequin ver. 3.5.2.2 . Nach Ausschluss von Schnecken, die nicht für Mäuse-Infektionen verwendet wurden, wurde die Differenzierung zwischen 132 Zerkarien aus 17 Schnecken in Gruppe A (für Methode I) und 122 Zerkarien aus 16 Schnecken in Gruppe B (für Methode II) getestet. Nach der Infektion wurde die Differenzierung zwischen 357 erwachsenen Würmern in Methode I und der ursprünglichen Zerkarienpopulation (132 Zerkarien aus Gruppe A) getestet. Außerdem wurden die 344 Würmer in Methode II gegen die 122 Zerkarien aus Gruppe B getestet. Außerdem wurde die Variation der erwachsenen Würmer bei 31 Mäusen in Methode I und der erwachsenen Würmer bei 22 Mäusen in Methode II getrennt bewertet. Bei den Miracidien wurde die genetische Differenzierung zwischen 93 Miracidien aus Lebern und 124 Miracidien aus Stühlen in Methode I getestet, und dasselbe für 88 Miracidien aus Lebern und Stühlen in Methode II.
Verwandtschaftsanalyse für Singletons von Zerkarien mit niMLGs
Die Anzahl der Zerkarien-Genotypen von jeder Schnecke wurde gezählt. Da es schwierig ist, Typisierungsfehler oder somatische Mutationen während der Sporozystenvermehrung vom ursprünglichen Miracidium-Genotyp zu unterscheiden, wurde eine Gruppe von Zerkarien-Genotypen mit weniger als zwei nicht übereinstimmenden Allelen als niMLGs identifiziert und einer Linie zugeordnet, die von demselben Miracidium in jeder Schnecke abstammt. Schließlich wurde die Anzahl der Miracidien, die in jeder Schnecke genetische Klone bildeten, auf der Grundlage der Liniennummer mit dem R-Paket allelematch ver. 2.5 ausgewertet.
Da davon ausgegangen wurde, dass Zerkarien mit niMLGs in einer Schnecke von einem Miracidium abstammen, wurde einer der Genotypen (Singleton) für niMLGs einer Gruppe von Zerkarien zugeordnet, die von einem Miracidium mit der Funktion amCluster in allelematch abstammen, um den gefilterten Datensatz für die Verwandtschaftsanalyse zwischen Miracidien zu erzeugen. Anschließend wurde die Verwandtschaft zwischen den einzelnen Zerkarien (Miracidien) anhand des Korrelationskoeffizienten der Allelgröße (I′) nach Streiff in SPAGeDi ver. 1.5a auf Intra-Schnecken- und Inter-Schnecken-Ebene für 20 Schnecken in Gruppe A und 25 Schnecken in Gruppe B geschätzt, um herauszufinden, ob die Aggregation von Miracidien in einer Schnecke mit der genetischen Ähnlichkeit von Miracidien korreliert.
Allelverteilung für Zerkarien-Teilmengen aus der unterschiedlichen Anzahl von Schnecken
Die ungleichmäßige genetische Verteilung der Zerkarien unter den Schnecken impliziert, dass die Stichprobengröße der Schneckenwirte die Allelverteilung der Zerkarien-Suprapopulation (Zerkarien aus allen Schnecken) beeinflussen würde. Na, der grundlegende Index für die Angabe der Genhäufigkeit einer Population, wurde für jeden Locus in verschiedenen Zerkarien-Teilmengen durch die zufällige Auswahl einer unterschiedlichen Anzahl von Schnecken weiter bewertet. Die Auswahl der Schnecken erfolgte nach dem Zufallsprinzip bei jeder gegebenen Anzahl von Schnecken, die in jeder Gruppe mit Hilfe der Basisfunktion sample in R auf 1 bis maximal 100 Wiederholungen festgelegt wurde. Bei jeder Wiederholung wurde die Anzahl der Zerkarien in jeder Schnecke auf 5 festgelegt, was entsprechend der praktischen Durchführbarkeit und der durchschnittlichen Anzahl der Zerkarien, die in dieser Studie in jeder Schnecke genotypisiert wurden, bestimmt wurde. Die Genotypen der Zerkarien für dieselbe Anzahl von Schnecken wurden zusammengeführt, und das Na wurde dann für jeden Locus mit der Funktion nb.alleles im R-Paket hierfstat geschätzt. Die Relativität zwischen genetischer Vielfalt und Schneckenzahl wurde bewertet, indem die kleinste Stichprobengröße von Schnecken berechnet wurde, wenn 50 % und 95 % der gesamten Na festgelegt wurden.
Genetischer Abstand zwischen weiblichen und männlichen erwachsenen Würmern
Um eine mögliche genetische Präferenz für S. japonicum während der Paarung zu erkennen, wurde der interindividuelle genetische Abstand Dsw zwischen dem Männchen und dem Weibchen jedes Paares in einzelnen Mäusen mit Populations ver. 1.3.32 (http://www.bioinformatics.org/~tryphon/populations/) gemessen und mit derjenigen zwischen den gepaarten weiblichen und den ungepaarten Würmern (falls vorhanden, ungepaart ist meist männlich) im selben Wirt verglichen.
Paternitätsidentifizierung für Miracidien
Die Allelhäufigkeiten aller erwachsenen Würmer und Miracidien in jeder Maus wurden analysiert und mit Hilfe der Funktion Allele Frequency Analysis in Cervus 3.0 berechnet. Alle 9 Loci wurden schließlich als geeignete Marker für weitere Abstammungsanalysen mit einer kombinierten Nicht-Ausschlusswahrscheinlichkeit von weniger als 0,01 % bewertet. Die Funktion Simulation der Abstammungsanalyse wurde auf der Grundlage der Allelhäufigkeit angewandt, um das Auflösungsvermögen der kodominanten Loci und die kritischen Werte der Log-Likelihood (LOD) mit folgenden Annahmen zu schätzen: 10.000 Nachkommen (Miracidien) für jede einzelne Maus; 10 Kandidatenmütter und -väter in jeder Maus (geschätzter Stichprobenumfang entsprechend der Anzahl der in einem Wirt gesammelten adulten Würmer); der Anteil der Kandidaten wurde auf 100 % der genotypisierten adulten Würmer festgelegt; andere Optionen wurden standardmäßig festgelegt. Schließlich wurden die beiden Ergebnisse der Allelhäufigkeitsanalyse und der Simulation der Abstammungsanalyse im Modul Abstammungsanalyse verwendet, um jeden Nachkommen seinen wahrscheinlichsten Eltern zuzuordnen. Die Eltern, bei denen mehr als 2 Allele nicht mit den Nachkommen übereinstimmen, wurden ausgeschlossen, und diejenigen, die den größten LOD aufwiesen, wurden als die wahrscheinlichsten Eltern betrachtet.
Statistische Analyse
Alle in der statistischen Analyse in dieser Studie verwendeten Daten sind kontinuierliche Daten. Die Signifikanz der Unterschiede bei den Indizes der genetischen Vielfalt (Na, Ae, Ar und Hs) der Loci, dem Verwandtschaftskoeffizienten (I′) und der interindividuellen genetischen Distanz (Dsw) zwischen zwei Gruppen wurde mit einem Signifikanzniveau von 0,05 bewertet. Zunächst wurde die Normalverteilung der Datensätze mit dem Sharpiro-Wilk-Test überprüft. Wenn die Datensätze normalverteilt waren, wurde der t-Test für gepaarte Stichproben/unabhängige Stichproben angewendet. Andernfalls wurden der Wilcoxon-Signed-Rank-Test und der Mann-Whitney-U-Test für die verbundenen/unabhängigen Stichproben angewandt. Die Bonferroni-Korrektur wurde zur Korrektur des P-Werts bei Mehrfachvergleichen verwendet.