E-Cadherin bindet an Desmoglein, um den Zusammenbau von Desmosomen zu erleichtern
1) Diese Arbeit befasst sich mit dem Mechanismus der Cadherin-vermittelten Regulierung des Desmosomenaufbaus. Die Gutachter sind sich zwar einig, dass die Arbeit potenziell spannend ist, aber sie haben mehrere wichtige Fragen aufgeworfen. Erstens sind sich alle einig, dass das Modell durch die Untersuchung der Ko-Lokalisierung in Zellen, die die Cadherin-Mutante exprimieren, getestet werden muss.
Wir danken den Gutachtern für die Anregung dieser wichtigen Experimente. Wie in unserer ausführlichen Antwort an die Gutachter beschrieben, haben wir nun die Rolle der verschiedenen Ecad-Mutationen bei der Behinderung der Rekrutierung von Dsg2 in Keratinozyten getestet. Wir haben Ecad WT in voller Länge und Ecad-Mutanten (L175D, K14E und W2A-K14E) in Ecad-Knockout- und Pcad-Knockdown-Mauskeratinozyten (EKO/PKD) exprimiert und die Rekrutierung von Dsg2 an Stellen mit interzellulären Kontakten analysiert. Diese Ergebnisse bestätigen, dass die Aminosäure L175 auf Ecad Dsg2-Interaktionen vermittelt und die frühe Bildung von Desmosomenkomplexen in Zellen erleichtert. Unsere Experimente zeigen auch, dass die Desmosomenbildung an den Stellen der trans-Homodimerisierung von Ecad eingeleitet wird.
2) Es gibt auch Bedenken hinsichtlich der Zuverlässigkeit der Ko-Lokalisierungsdaten in Abbildung 5; eine genauere Analyse ist erforderlich, um zu zeigen, dass die Ko-Lokalisierung von E-Cadherin und Desmoplakin viel häufiger vorkommt, als zufällig zu erwarten wäre.
In der Praxis werden Desmosomen durch die Größe und das schienenförmige Aussehen der DP-Färbung in SIM-Bildern identifiziert. Wie in unserer Antwort an die Gutachter dargelegt, haben wir diesen etablierten Ansatz zur Lokalisierung von Desmosomen verwendet. Außerdem betonen wir jetzt, dass wir nicht die Kolokalisierung messen, sondern die Rekrutierung verschiedener Cadherine (Ecad und Dsg) in Regionen der Membran, die dieses Muster aufweisen.
3) Zweitens geht die Modellierung davon aus, dass L175 einen Teil der Schnittstelle bildet, aber ohne Bewertung der Stöchiometrie kann nicht ausgeschlossen werden, dass der Verlust der Bindung ein indirekter Effekt des Verlustes der cis-Dimerisierung ist. Die Modellierung wird auch als schwach angesehen, da keine komplementären Schnittstellen auf Dsg2 getestet wurden. Ohne solche Daten muss die molekulare Modellierung als höchst spekulativ angesehen werden.
Wie in unserer ausführlichen Antwort an die Gutachter beschrieben, zeigen frühere Computersimulationen und biophysikalische Experimente, dass die cis-Dimerbildung von Ecad eine vorherige trans-Dimerisierung erfordert. Folglich können Ecads nicht als eigenständige, vorgeformte cis-Dimere an die Oberfläche binden. Dies macht es äußerst unwahrscheinlich, dass die gemessenen Bindungsinteraktionen zwischen Ecad cis-Dimeren und Dsg2 stattfinden. Nichtsdestotrotz stimmen wir mit den Gutachtern überein, dass die molekularen Docking-Ergebnisse recht schwach sind. Wir haben daher diese Modellierungsergebnisse aus dem Manuskript gestrichen.
4) Schließlich, wie von Gutachter 3 angemerkt, erklären das Modell und der Diskussionsabschnitt nicht wirklich, wie E-Cadherin Desmosomen reguliert, selbst wenn sie durch diese Ergänzungen unterstützt werden.
Auf der Grundlage unserer neuen zellulären Struktur-Funktions-Daten schlagen wir nun ein Modell vor, bei dem die Desmosomenbildung sowohl durch die direkten cis-Interaktionen von Ecad und Dsg2 als auch durch die trans-Bindung des entgegengesetzten Ecad erleichtert wird. In unserem Modell dient die trans-Homodimerisierung von Ecad aus gegenüberliegenden Zellen als räumlicher Anhaltspunkt für die Koordinierung des Desmosomenaufbaus. Ecad bildet anschließend cis-Dimerkomplexe mit Dsg2, um die Desmosomenbildung einzuleiten. Das Modell wird in dem neuen Manuskript vorgestellt und diskutiert.
Reviewer #1:
1) Die Einzelmolekül-AFM-Experimente sind der solideste Teil der Arbeit. Nach meiner Lesart schließen die Autoren jedoch nicht aus, dass die beobachteten Bindungsereignisse auf Wechselwirkungen zwischen präformierten E-Cadherin-cis-Dimeren zurückzuführen sind. Es ist wichtig, die Stöchiometrie der Interaktion zu bestimmen, denn wenn die Bindung an Dsg2 ein E-Cadherin-cis-Dimer erfordert, würde dies die Interpretation des Ergebnisses ändern, dass die L175D-Mutation die Dsg2/E-Cad-Interaktion blockiert. Ein solches Szenario würde auch die Gültigkeit der Docking-Simulationen in Frage stellen. Meiner Ansicht nach ist die geringe Wahrscheinlichkeit einer Bindung pro Kontakt der AFM-Spitze mit der Oberfläche ein schwacher Beweis dafür, dass die Bindung notwendigerweise die Interaktion zweier Monomere widerspiegelt, ebenso wie die geringe durchschnittliche Dichte der Cadherin-Moleküle auf der Oberfläche. Außerdem sind die Cadherine mit Streptavidin immobilisiert, das über mehrere Biotin-Bindungsstellen verfügt.
Aus diesen Gründen halte ich es für wichtig zu beweisen, dass eine Heterodimerisierung zwischen Monomeren stattfindet. Dazu würde ich empfehlen, die Interaktionswahrscheinlichkeit der Spitze mit der Oberfläche in Abhängigkeit von der Flächendichte von E-Cadherin auf der Deckglasoberfläche systematisch zu messen. Wenn die Interaktion tatsächlich monomeres E-Cadherin erfordert, sollte diese Messung zumindest bei niedrigen Dichten linear mit dem zugegebenen E-Cadherin skalieren. Diese spezifische Messung ist jedoch nicht erforderlich – jede Messung, die die Stöchiometrie bestimmt, ist ausreichend.
Vorangegangene Computersimulationen (Wu et al., 2010; Wu et al., 2011) haben gezeigt, dass die Ecad cis-Homodimerisierung die vorherige Ecad trans-Dimerbildung erfordert. Ebenso haben frühere Einzelmolekül-FRET-Messungen gezeigt, dass es nicht möglich ist, eigenständige Ecad-cis-Dimere zu bilden, selbst wenn Ecad-Monomere in unmittelbarer Nähe in einer cis-Ausrichtung angeordnet sind (Zhang et al., 2009). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass Ecads in unseren Experimenten nicht als vorgeformte cis-Dimere auf der AFM-Spitze oder dem Substrat immobilisiert werden können. Folglich ist das Versagen der Ecad-L175D-Mutante bei der Interaktion mit Dsg2 nicht auf das Fehlen der Ecad-cis-Dimerisierung zurückzuführen. Wir diskutieren dies nun im Unterabschnitt „Leu 175 vermittelt Ecad- und Dsg2-Wechselwirkungen“ des Manuskripts.
Bedauerlicherweise erlauben die technischen Einschränkungen nicht das vom Rezensenten vorgeschlagene Proteinstöchiometrie-Experiment. In unseren Experimenten verwenden wir Proteinoberflächendichten, die es uns erlauben, einzelne Bindungsereignisse anhand der entsprechenden Dehnung von PEG-Tethern eindeutig zu identifizieren. Wenn die Cadherin-Oberflächendichte erhöht wird, wie vom Rezensenten vorgeschlagen, steigt die Wahrscheinlichkeit gleichzeitiger multipler Ecad-Bindungsereignisse, was eine quantitative Analyse der Proteinbindungswahrscheinlichkeit unzuverlässig macht. Aus diesem Grund (und wegen der inhärenten Schwäche unserer Docking-Analyse) haben wir die Protein-Docking-Simulationen aus dem Manuskript ausgeschlossen.
Im überarbeiteten Manuskript verwenden wir nun eine Cluster-Analyse, um die Einzelmolekül-Entbindungsereignisse für die dynamische Kraftspektroskopie (DFS) zu gruppieren. Wir haben kürzlich gezeigt, dass der von uns verwendete K-Means-Cluster-Algorithmus die Schätzung der kinetischen Parameter in der DFS erheblich verbessert (Yen und Sivasankar, 2018). Folglich sind die Lebensdauern, die wir jetzt für Ecad/Dsg2, Dsc2/Dsg2 und Dsc2/Dsc2-Wechselwirkungen berichten, zuverlässiger.
2) Die Docking-Simulationen sind interessant, bieten meiner Meinung nach aber nur schwache Beweise für die spezifische Bindungsgeometrie, die die Autoren vorschlagen. Ich würde den Autoren dringend empfehlen, bei der Interpretation und Präsentation dieser Ergebnisse vorsichtiger zu sein oder alternativ zusätzliche Daten, z.B. EM-Bilder, zu präsentieren, die das Rechenergebnis unterstützen oder widerlegen.
Wir stimmen mit dem Gutachter überein, dass die Protein-Docking-Daten schwach sind. Wir haben daher diese Ergebnisse aus dem Manuskript entfernt.
3) Leider sind die SIM-Bilder in der vorliegenden Form nicht überzeugend. Insbesondere ist nicht klar, was in der Analyse der Autoren als „Desmosom“ zählt (Abbildung 5B). Eine ausgefeiltere Behandlung der Kolokalisierung wäre erforderlich, um festzustellen, dass E-Cadherin und Desmoplakin kolokalisieren und dass diese Kolokalisierung mit zunehmender Reifung der Verbindungsstellen abnimmt.
In früheren Studien (Stahley et al., 2016a, 2016b) haben wir das „Eisenbahngleis“-Erscheinungsbild von DP, wie es durch superauflösende Bildgebung aufgedeckt wird, genutzt, um Desmosomen durch Immunfluoreszenz zu definieren (wie in Abbildung 3A dargestellt). Auch andere Wissenschaftler haben die Morphologie von „Eisenbahnschienen“ zur Identifizierung von Desmosomen in SIM-Bildern verwendet (siehe z. B.: Chen et al., (2012); Ungewiß et al., (2017)). Die Größe und Organisation dieser Strukturen, wie sie von SIM offenbart werden, stimmen vollständig mit den klassischen EM-Definitionen von Desmosomen überein. Wir haben die Pixelintensität für die beiden Cadherine (Ecad oder Dsg2) innerhalb dieser Strukturen mit einer Standard-Bildanalyse gemessen. Wichtig ist, dass wir nicht versuchen, eine Ko-Lokalisierung zu behaupten. Vielmehr messen wir die Rekrutierung von Cadherin an Membrandomänen, die DP-Rail-Road-Track-Färbemuster aufweisen. Wir sind uns bewusst, dass es manchmal schwierig ist, Bahngleise zu frühen Zeitpunkten zu erkennen. Aus diesem Grund waren wir der Meinung, dass wir frühestens nach 1 Stunde eine bona fine railroad track staining erkennen können. Darüber hinaus führen wir nur Messungen an Stellen durch, an denen wir Gleismuster und keine DP-Pünktchen beobachten können. Schließlich stimmt unser Ergebnis, dass Ecad in entstehenden Desmosomen vorhanden ist, mit klassischen Immuno-EM-Experimenten überein, die zeigen, dass Ecad an Desmosomen lokalisiert werden kann (Jones, 1988). Daher sind wir zuversichtlich, dass wir Desmosomen identifizieren und die relativen Mengen der beiden Cadherine zu verschiedenen Zeitpunkten messen können.
4) Diesen letzten Punkt überlasse ich dem Ermessen des Herausgebers. Meiner Ansicht nach belegen die Kolokalisationsdaten, selbst wenn sie als wahr angenommen werden, keine funktionelle Relevanz. Es wäre sehr schön, ein Knockdown/Rekonstitutions-Experiment mit L175D E-Cadherin zu sehen. Die Vorhersage ist, dass dieses Molekül niemals mit Desmoplakin kolokalisieren würde, unabhängig vom Alter der Verbindungsstelle. Ein Verstoß gegen diese Vorhersage würde das von den Autoren favorisierte Modell in Frage stellen.
Auf Anregung des Rezensenten haben wir nun Experimente durchgeführt, um die Rolle der verschiedenen extrazellulären Ecad-Domänenmutationen bei der Behinderung der Rekrutierung von DP und Dsg2 in Keratinozyten direkt zu testen. Diese Daten sind im Unterabschnitt „Ecad L175 ist essentiell für eine effiziente interzelluläre Dsg2-Rekrutierung und Desmosomenbildung“ beschrieben. Die entsprechenden Bilder sind in Abbildung 5 und in Abbildung 5-Figure Supplement 1 dargestellt. Die verwendeten Methoden sind im Unterabschnitt „Isolierung, Kultur, Transfektion und konfokale Bildgebung von primären Keratinozyten“ beschrieben. Für diese Experimente haben wir EKO/PKD-Mauskeratinozyten verwendet, die praktisch keine klassischen Cadherine exprimieren. Wir haben bereits gezeigt, dass diese EKO/PKD-Keratinozyten aufgrund des Verlusts aller klassischen Cadherine nicht in der Lage sind, AJs und Desmosomen zu assemblieren (Michels et al., 2009). Diese Zellen ermöglichen es uns daher, die Fähigkeit der Ecad-Mutanten direkt zu beurteilen, i) die AJ-Bildung zu initiieren und ii) ihre Fähigkeit zu beurteilen, desmosomale Komponenten an Stellen zu rekrutieren, an denen der erste Zell-Zell-Kontakt entsteht.
Da wir daran interessiert waren, die Fähigkeit der Ecad-Mutanten zur Rekrutierung desmosomaler Proteine in einem frühen Stadium der Verbindungsbildung zu beurteilen, exprimierten wir entweder Ecad WT oder Mutanten in voller Länge in EKO/PKD-Keratinozyten und analysierten die DP- und Dsg2-Rekrutierung an den Stellen der interzellulären Kontakte mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie. Um die Rekrutierung in verschiedenen Stadien der Verbindungsbildung und Reifung zu untersuchen, wurden Keratinozyten fixiert und zu drei Zeitpunkten nach dem Ca2+-Switch (3 Stunden, 6 Stunden und 18 Stunden) immungefärbt für DP, Dsg und Ecad.
Unsere Daten zeigten, dass 3 Stunden nach dem Ca2+-Switch 93% von WT-Ecad in reißverschlussartigen frühen AJs an Stellen interzellulärer Kontakte angereichert waren. Im Gegensatz dazu bildeten nur 48 % der mit L175D-Ecad transfizierten Keratinozyten AJ-Zipper, was wahrscheinlich auf eine beeinträchtigte Ecad-Cis-Dimer-Bildung zurückzuführen ist (Abbildung 5 A, B). Zu diesen frühen Zeitpunkten nach dem Ca2+-Switch waren 66 % und 91 % der WT-Ecad-Reißverschlusskontakte positiv für Dsg2 bzw. DP (Abbildung 5 A, C, D, E). Wenn die Zellen 18 Stunden lang eine Ca2+-abhängige interzelluläre Adhäsion ausüben durften, stieg die Lokalisierung von Ecad-Dsg2 und Ecad-DP auf 97 % bzw. 100 % an (Abbildung 5 A, C, D, E). Im Gegensatz dazu zeigten nur 39 % der L175-induzierten Reißverschlusskontakte 3 Stunden nach dem Wechsel zu hohem Ca2+ eine Dsg2-Rekrutierung, die nach 18 Stunden auf 65 % anstieg (Abbildung 5 A, C). Dies bestätigt, dass eine direkte Interaktion zwischen Ecad und Dsg2 für eine effiziente Rekrutierung von Dsg2 an frühe interzelluläre Kontakte erforderlich ist. In ähnlicher Weise waren nach 3 Stunden nur 28 % der von der L175D-Ecad-Mutante hergestellten interzellulären Kontakte positiv für DP, was sich nach 18 Stunden auf 72 % erhöhte, was auf einen kompensatorischen Mechanismus in späteren Stadien schließen lässt (Abbildung 5 D, E).
Um zu bestätigen, dass die beobachtete Wirkung der L175D-Mutation nicht auf eine behinderte AJ-Bildung zurückzuführen ist, haben wir die EKO/PKD-Keratinozyten mit der Ecad-K14E-Mutante in voller Länge transfiziert, die die X-Dimer-Bildung verhindert und Ecad in einer Strangtausch-Dimer-Konformation gefangen hält. Unsere Daten zeigten, dass nur 4 % der transfizierten Kontaktzellen zu frühen Zeitpunkten (3 Stunden) nach dem Wechsel zu hohem Ca2+ Zipper bildeten und nur 24 % der transfizierten Kontaktzellen zu späten Zeitpunkten (18 Stunden) Zipper aufwiesen (Abbildung 5 A, B, Abbildung 5-figure supplement 1), was bestätigt, dass K14 für eine effektive AJ-Bildung und damit für die Herstellung interzellulärer Kontakte unerlässlich ist. Allerdings rekrutierten die wenigen K14E-AJs, die gebildet wurden, Dsg2 und insbesondere DP effizienter als L175D (Abbildung 5 A, C, E, Abbildung 5-figure supplement 1). Dieses Ergebnis bestätigt, dass die verzögerte Rekrutierung von Dsg2 an interzelluläre Kontakte nicht auf die Unfähigkeit von Ecad L175D zur effizienten Bildung von AJs zurückzuführen ist, sondern eher auf das Fehlen einer direkten Interaktion zwischen Ecad und Dsg2. Da es in Abwesenheit von Zippern nie zu einer Ko-Lokalisierung von DP und Ecad kam (Abbildung 5-figure supplement 1), deuten die Daten auch darauf hin, dass Ecad-Trans-Interaktionen den Ecad/Dsg2-Interaktionen vorausgehen. Diese Schlussfolgerung wird durch die Feststellung untermauert, dass keine DP-Rekrutierung beobachtet wurde, wenn die Ecad-Trans-Adhäsion und damit die Zipper durch Transfektion der Ecad-DM in voller Länge (W2A-K14E-Doppelmutante, Abbildung 5-figure supplement 1) in EKO/PKD-Keratinozyten aufgehoben wurden. Zusammengenommen bestätigen diese Ergebnisse, dass die Aminosäure L175 die Interaktion mit Dsg2 vermittelt und die frühe Bildung des Desmosomenkomplexes in Zellen erleichtert.
Reviewer #2:
1) Die Erkenntnis, dass der E-Cadherin-Rest L175 für die Interaktion mit Dsg2 entscheidend ist, ist faszinierend. Es wurden jedoch keine interagierenden Partnerreste identifiziert. Unter diesen Umständen scheint die Vorhersage einer Konformation für die E-Cadherin/Dsg2-Interaktion durch Docking unsicher; es scheint unsicher, ob die vorhergesagte Konformation mit der tatsächlichen gebundenen Konformation übereinstimmt.
Wir stimmen mit dem Gutachter überein, dass die Protein-Docking-Daten spekulativ sind und haben daher diese Ergebnisse aus dem Manuskript gestrichen.
2) Es gibt nur einen schwachen Zusammenhang zwischen der vorgeschlagenen Dsg2/E-Cadherin-Interaktion und der Biologie des Desmosomenaufbaus. Dennoch scheinen die Autoren einen klaren Weg zu haben. Sie argumentieren, dass das Vorhandensein von E-Cadherin in den entstehenden Desmosomen (experimentell durch Mitfärbung für Desmoplakin in Abbildung 5) ein Beweis für die Rolle der von ihnen identifizierten Dsg2/E-Cadherin-Assoziation ist. Nachdem sie nun eine Mutante identifiziert haben, die diese Assoziation verhindert, sollten die Experimente in Abbildung 5, die mit dieser Mutante durchgeführt werden, zu anderen Ergebnissen führen.
Wie in Antwort 4 auf Reviewer 1 beschrieben, haben wir Ecad WT und Ecad-Mutanten in voller Länge in EKO/PKD-Keratinozyten exprimiert und die Rekrutierung von Dsg2 und DP an Stellen mit interzellulären Kontakten analysiert. Diese Ergebnisse bestätigen, dass die Aminosäure L175 Dsg2-Interaktionen vermittelt und die frühe Desmosomenkomplexbildung in Zellen erleichtert. Diese Daten werden im Unterabschnitt „Ecad L175 ist für eine effiziente interzelluläre Dsg2-Rekrutierung und Desmosomenbildung unerlässlich“ des Manuskripts beschrieben. Die entsprechenden Bilder sind in Abbildung 5 und in Abbildung 5-Figure Supplement 1 zu sehen. Die verwendeten Methoden sind im Unterabschnitt „Isolierung, Kultur, Transfektion und konfokale Bildgebung primärer Keratinozyten“ beschrieben.
Reviewer #3:
1) Dieses Manuskript identifiziert und charakterisiert eine molekulare Interaktion zwischen E-Cadherin und Desmoglein 2 unter Verwendung isolierter Proteine und zeigt eine verstärkte Kolokalisierung zwischen diesen beiden Molekülen in Keratinozyten zu Beginn der Desmosomenbildung. Dies sind potenziell sehr interessante Beobachtungen, die erklären könnten, wie klassische Cadherine die Bildung von Desmosomen kontrollieren. Obwohl dies von mehreren Gruppen in der Literatur gut dokumentiert ist, sind die zugrunde liegenden Mechanismen noch weitgehend unbekannt. Die Schlussfolgerung „Our integrated single molecule experiments, protein-protein docking predictions and cell based super resolution imaging show that Ecad/Dsg2 interactions play an important role in early desmosome assembly“ zu Beginn des Abschnitts „Discussion“ ist jedoch eine ziemlich starke Übertreibung, wenn man bedenkt, dass die Interaktion auf der Charakterisierung isolierter extrazellulärer Domänen und statischer, wenn auch hochauflösender Mikroskopie beruht. Es wird kein Experiment durchgeführt, um zu zeigen, dass der Zusammenbau von Desmosomen tatsächlich beeinträchtigt wird, wenn man diese Interaktion stört, was meiner Meinung nach das Mindeste wäre, um diesen Datensatz wirklich interessant und relevant für ein breites Publikum zu machen.
Wie in Antwort 4 auf Gutachter 1 beschrieben, haben wir nun Ecad WT und Ecad-Mutanten in voller Länge in EKO/PKD-Keratinozyten exprimiert und gezeigt, dass die Aminosäure L175 Dsg2-Interaktionen vermittelt und die frühe Desmosomenbildung in den Zellen erleichtert, wie durch die DP-Rekrutierung bewertet. Diese Daten werden im Unterabschnitt „Ecad L175 ist essentiell für eine effiziente interzelluläre Dsg2-Rekrutierung und Desmosomenbildung“ des Manuskripts beschrieben. Die entsprechenden Bilder sind in Abbildung 5 und in Abbildung 5-Figure Supplement 1 zu sehen. Die verwendeten Methoden sind im Unterabschnitt „Isolierung, Kultur, Transfektion und konfokale Bildgebung von primären Keratinozyten“ beschrieben.
2) Auch angesichts der Tatsache, dass die Interaktion kalziumunabhängig ist, während die klassische cadherinabhängige frühe Desmosomenbildung die Anwesenheit von Kalzium erfordert (was überhaupt nicht diskutiert wird).
Wir danken dem Gutachter für diesen aufschlussreichen Kommentar. Wie im Unterabschnitt „Ecad L175 ist essentiell für eine effiziente interzelluläre Dsg2-Rekrutierung und Desmosomen-Assemblierung“ beschrieben, zeigt die konfokale Bildgebung von mutiertem Ecad, das in Mäusekeratinozyten exprimiert wird, dass die Desmosomen-Assemblierung an Stellen mit Ca2+-abhängiger Ecad trans-Homodimerisierung initiiert wird. Auf der Grundlage unserer Daten schlagen wir ein Modell vor, bei dem die Desmosomenbildung sowohl durch die direkten cis-Interaktionen von Ecad und Dsg2 als auch durch die trans-Bindung von entgegengesetztem Ecad gefördert wird. In unserem Modell dient die trans-Homodimerisierung von Ecad aus gegenüberliegenden Zellen als räumlicher Anhaltspunkt für die Koordinierung des Desmosomenaufbaus. Ecad bildet anschließend cis-Dimerkomplexe mit Dsg2. Sobald es im nativen Desmosom lokalisiert ist, dissoziiert Dsg2 von Ecad und bindet an Dsc2, um reife Desmosomen zu bilden. Da der Dsc2/Dsg2-Komplex eine längere Lebensdauer hat als der Ecad/Dsg2-Komplex und der Dsc2/Dsc2-Komplex, ermöglicht dies wahrscheinlich eine robuste Zell-Zell-Adhäsion und erlaubt es dem reifen Desmosom, mechanischen Kräften zu widerstehen. Dieses Modell wird in Abbildung 6 und im Abschnitt „Diskussion“ beschrieben.
3) Da es sich um eine völlig neue Interaktion mit geringer Affinität handelt, ist es wahrscheinlich schwierig, Interaktionstests im Zusammenhang mit Zellen durchzuführen, bei denen eine Zelle E-Cadherin und die andere Dsg2 exprimiert, um zu untersuchen, ob eine Interaktion stattfindet. Da ihre Daten jedoch teilweise auf einer Modellierung beruhen, sollten die Autoren auch eine Mutante erzeugen, in der A125 und A124 mutiert sind, um einen besseren Beweis für die Existenz der vorgeschlagenen y-Dimere zu liefern.
Da die Protein-Docking-Ergebnisse nicht robust sind, haben wir diese Daten nun aus dem Manuskript entfernt. Unsere Experimente mit EKO/PKD-Keratinozyten, die zeigen, dass die Mutation der Aminosäure L175 auf Ecad die Rekrutierung von Dgs2 und insbesondere DP an Stellen der frühen Kontaktbildung beeinträchtigt, zeigen jedoch, dass Ecad-L175 die Desmosomenbildung in Zellen erleichtert, und bestätigen unsere biophysikalischen Ergebnisse.
Zusammenfassung:
Die Gutachter sind der Meinung, dass die biophysikalischen Daten zwar überzeugend sind, aber eine strengere quantitative Analyse erforderlich ist, um die Schlussfolgerungen aus den Daten in den Abbildungen 3 und 5 zu untermauern. Im Prinzip können diese Bedenken mit zusätzlicher Datenanalyse anstelle von Experimenten angegangen werden, und in diesem Fall würden wir ein überarbeitetes Manuskript in Betracht ziehen.
Wir danken dem Herausgeber für diese ermutigende Rezension. Wie im Folgenden beschrieben, geht unser überarbeitetes Manuskript auf alle hervorgehobenen Punkte ein.
1) Die Schlussfolgerung, dass die Interaktion zwischen E-Cadherin und Dsg für die anfängliche Desmosomenbildung erforderlich ist, basiert auf der Kolokalisierung von Dsg und E-Cadherin, die mit der Reifung der Verbindung abnimmt. In Abbildung 3 ist jedoch nicht klar, ob die beobachtete Kolokalisierung mit DP signifikant über das hinausgeht, was zufällig zu erwarten wäre, oder ob sie auf zeitabhängige Veränderungen der subzellulären E-Cadherin-Lokalisierung zurückzuführen ist, die nicht mit der Reifung der Verbindungsstelle zusammenhängen. In Abbildung 3C zeigen die Kontrollexperimente auf der rechten Seite die Kolokalisierung von Dsg2 und DP – bekannte Desmosom-Komponenten – und zeigen eine enge Übereinstimmung der Fluoreszenzsignale zu allen drei Zeitpunkten. Im Gegensatz dazu scheint sich die Expression von E-Cadherin und DP in den linken Feldern zwar bis zu einem gewissen Grad zu überlappen, doch zeigen sie nicht die bei den Kontrollexperimenten beobachtete Übereinstimmung der Signale. Die Antwort auf die ursprünglichen Kritikpunkte zu diesem Thema (z.B. Reviewer 1, Punkt 3) konzentriert sich auf die Definition eines Desmosoms, geht aber nicht auf den obigen Punkt ein.
Wir möchten klarstellen, dass wir nicht die Ko-Lokalisation messen, sondern die Rekrutierung von Ecad oder Dsg2 an Regionen der Membran, die ein DP-„Eisenbahnschienen“-Muster aufweisen. Um dies deutlicher zu machen, haben wir das überarbeitete Manuskript geändert, um zu betonen, dass Ecad „in naszierenden Desmosomen angereichert ist“ und nicht „von reifen Desmosomen ausgeschlossen ist“.
Um die Bedenken der Gutachter bezüglich unserer Messung der Ecad-Anreicherung in Desmosomen direkt anzusprechen, zeigen wir nun, dass die relativen Ecad-Konzentrationen entlang der gesamten Zellgrenze (Ecad:DP-Verhältnis an Zellgrenzen) im Laufe der Zeit unverändert bleiben. Diese Daten bestätigen, dass die Ecad-Anreicherung innerhalb der DP-Bahnspuren zu frühen Zeitpunkten spezifisch für desmosomale Regionen der Membran ist und signifikant über das hinausgeht, was durch Zufall oder aufgrund von Veränderungen der E-Cadherin-Lokalisierung, die nicht mit der Reifung der Verbindungsstellen zusammenhängen, erwartet wird. Die Daten sind in Abbildung 3-figure supplement 1 dargestellt und werden im Unterabschnitt „Ecad ist in naszierenden Desmosomen, aber nicht in reifen Desmosomen vorhanden“ beschrieben.
Da die in Abbildung 3 gezeigten Linienscans verwirrend waren, haben wir sie aus dem überarbeiteten Manuskript entfernt. Stattdessen zeigen wir in Abbildung 3B nun mehrere repräsentative Bilder von desmosomalen Regionen in menschlichen Keratinozyten, die 1, 3 oder 18 Stunden lang in Medien mit hohem Ca2+-Gehalt kultiviert wurden. Diese Ergebnisse unterstreichen die Hauptaussage von Abbildung 3C: Die Ecad-Konzentrationen sind in den entstehenden Desmosomen angereichert, wobei die relativen Konzentrationen mit zunehmender Reifung der Desmosomen abnehmen.
2) Ähnliche Bedenken wurden in Bezug auf Abbildung 5 geäußert, die zeigen soll, dass Ecad L175 für eine effiziente interzelluläre Dsg2-Rekrutierung und Desmosomenbildung unerlässlich ist. Die Bilder in Tafel A zeigen tatsächlich einen dramatischen Unterschied in der Lokalisierung von Dsg2 und DP im Vergleich zum WT- oder mutierten Cadherin. Während Dsg2 und DP mit WT- oder K14E-Ecad an Verbindungsstellen kolokalisieren, bleiben sie in separaten Pünktchen, die die L175D-Ecad-Verbindung flankieren, und kolokalisieren nicht mit ihr. Es ist jedoch nicht klar, was die Autoren quantifiziert haben, um die Bedeutung dieses Phänotyps zu testen. Was bedeutet in B „% der Kreuzung, die Kontakte bildet“? Wie wird ein Kontakt definiert? Welche Übergänge werden gemessen? AJ oder Desmosomen? Was ist in C und E mit „% der Dsg2- oder DP-positiven Verbindungsstellen“ gemeint? Wie wurden die Verbindungsstellen definiert?
Wir haben jetzt eine Abbildungstafel (Abbildung 5-Figure Supplement 1A) hinzugefügt, um die Quantifizierungskriterien und die Kategorien der Verbindungsstellen zu veranschaulichen, die in unserer Analyse verwendet wurden. Diese Tafel zeigt Beispiele von Zellen, die mit der Ecad-Mutante transfiziert wurden und keine (linke Tafel) oder eine (rechte Tafel) interzelluläre AJ-Bildung aufweisen. Für die Dsg2- oder DP-Rekrutierung haben wir nur diejenigen interzellulären Schnittstellen quantifiziert, an denen AJ-Zipper beobachtet wurden. In den Einschüben der Abbildung zeigen wir Beispiele von AJ-positiven Kontakten, die entweder positiv für DP oder negativ für DP sind.
Im Unterabschnitt „Ecad L175 ist essentiell für eine effiziente interzelluläre Dsg2-Rekrutierung und Desmosomenbildung“ des Manuskripts geben wir nun an, dass die Fähigkeit transfizierter Keratinozyten, AJs zu bilden, zunächst durch die Bildung von „reißverschlussartigen“ Mustern von Ecad an interzellulären Kontakten bewertet wurde. Wir haben zuvor gezeigt, dass diese Zipper frühe AJs darstellen und AJ-Markerproteine wie Vinculin rekrutieren (Rübsam et al., 2017). Wir haben nur interzelluläre Schnittstellen mit AJ-Zippern auf ihre Fähigkeit untersucht, Dsg2 und DP an diese Kontakte zu rekrutieren. Wichtig ist, dass wir nie eine Anreicherung von desmosomalen Komponenten an interzellulären Kontakten in Abwesenheit von AJ-Zippern beobachtet haben (Michels et al., 2009).
Wie in Antwort 3a unten beschrieben, diskutieren wir nun im Abschnitt Diskussion, dass, obwohl Dsg2 und DP innerhalb von 3 Stunden eine gewisse Co-Lokalisierung an Ecad-positiven Zippern zeigen, es auch eine nicht überlappende Färbung der Verbindungsstellen gibt, was darauf hindeutet, dass AJs und Desmosomen bereits beginnen, sich in verschiedene interzelluläre Verbindungsstellen zu trennen. Wir haben diese Ko-Lokalisierung in unserem Manuskript nicht quantifiziert, da der Hauptpunkt unserer Experimente darin bestand, die Bedeutung von L175 für die Rekrutierung von Dsg2 an interzelluläre Schnittstellen und die Erleichterung der Desmosomenbildung zu zeigen (wie durch die DP-Rekrutierung an interzelluläre Kontakte veranschaulicht). Wir glauben, dass die Verzögerung bei der Rekrutierung zwischen WT, der L175-Mutante und der K14-Mutante, die in Abbildung 5 quantifiziert wird, diesen Punkt illustriert.
3) Es sind auch Änderungen im Abschnitt „Einleitung und Diskussion“ erforderlich, um die oben genannten Punkte sowie die Zugänglichkeit des Papiers anzusprechen:
a) In Bezug auf die oben genannten Punkte scheint die Verbindung zwischen In-vitro-Bindungsexperimenten und der vorgeschlagenen biologischen Rolle schwach zu sein, basierend auf Lokalisierungsstudien, die überlappende, aber nicht wirklich kolokalisierte Färbemuster zeigen. Die Autoren müssen dieses Ergebnis erklären; vielleicht ist die Ko-Lokalisierung dynamisch und/oder nur eine Teilmenge der E-Cadherin-Moleküle ist an Dsg2 gebunden. Dieser Punkt muss zumindest diskutiert werden, um die Ergebnisse der Lokalisierungsexperimente mit dem vorgeschlagenen Modell in Einklang zu bringen.
Aufgrund des flüchtigen Charakters der Ecad/Dsg2-Interaktionen wird erwartet, dass sich die an den Verbindungsstellen rekrutierten desmosomalen Proteine schnell von Ecad ablösen. Folglich ist zu erwarten, dass Bilder von interzellulären Grenzflächen sowohl überlappende als auch getrennte Färbemuster von Ecad und desmosomalen Proteinen aufweisen. Obwohl Dsg2 und DP eine gewisse Ko-Lokalisierung an Ecad-positiven Zippern aufweisen (Abbildung 5), wird eine signifikante, sich nicht überlappende Färbung der Grenzflächen beobachtet, sogar innerhalb der ersten drei Stunden. Dies deutet darauf hin, dass sich AJs und Desmosomen schnell in verschiedene interzelluläre Verbindungen aufspalten. Wir führen dies nun im Abschnitt Diskussion an.
b) Zu Beginn des Abschnitts Diskussion behaupten die Autoren, dass sie: „zwei kritische Ereignisse identifizieren, die eine effiziente Desmosomenbildung initiieren und fördern: (i) die stabile trans-Homodimerisierung von Ecad und (ii) die direkte heterophile Bindung von Ecad und Dsg2-Ectodomänen. Unsere Daten zeigen, dass der Desmosomenzusammenbau an den Stellen der trans-Homodimerisierung von Ecad eingeleitet wird. Anschließend binden sich Ecad und Dsg2 über ein konserviertes Leu 175 an der cis-Bindungsschnittstelle von Ecad und bilden kurzlebige heterophile Komplexe, die an frühen Desmosomen lokalisiert sind und desmosomale Proteine effizient an Stellen rekrutieren, an denen interzelluläre Kontakte entstehen. Wenn Desmosomen reifen, dissoziiert Dsg2 von Ecad und bildet stabile Bindungen mit Dsc2, um eine robuste Adhäsion zu vermitteln. – Dieser Absatz vermischt Beobachtungen, Interpretationen und hypothetische Modelle und ist daher irreführend. Sie sollten die Zusammenfassung der Ergebnisse von der Interpretation und ihrem Modell trennen.
Wie von den Gutachtern vorgeschlagen, haben wir die Interpretationen aus dem ersten Absatz des Diskussionsabschnitts entfernt und fassen jetzt nur die Ergebnisse zusammen.
c) Die Autoren schreiben in der Zusammenfassung und Einleitung „Ecad interagiert mit Dsg2 über ein konserviertes Leu 175 auf der Ecad cis-Bindungsschnittstelle.“ – Die Autoren sollten nicht davon ausgehen, dass die Leser mit den homophilen Interaktionen von Ecad vertraut sind, und sollten dies explizit erklären.
In der Zusammenfassung heißt es nun: „Frühere Studien zeigen, dass E-Cadherin (Ecad), ein adhäsives Protein, das sowohl in trans- als auch in cis-Konformationen interagiert, den Zusammenbau von Desmosomen über einen unbekannten Mechanismus erleichtert.“
Außerdem heißt es in der Einleitung nun: ‚Da Ecad lateral interagiert, um cis-Dimere auf derselben Zelloberfläche zu bilden (Harrison et al., 2011), während Ecad-Moleküle aus gegenüberliegenden Zellen in einer trans-Strangwechsel-Dimer-Konformation interagieren (Boggon et al., 2002; Parisini et al., (Boggon et al., 2002; Parisini et al., 2011) und einer trans-X-Dimer-Konformation (Ciatto et al., 2010; Harrison et al., 2010) interagieren, haben wir Mutanten verwendet, die spezifisch entweder die trans- oder die cis-Interaktionen von Ecad aufheben, und ihre Bindung an Dsg2 oder Dsc2‘ getestet. Schließlich heißt es jetzt in der Einleitung: „Frühere Strukturstudien haben gezeigt, dass L175 die homophile Ecad-cis-Dimerisierung vermittelt (Harrison et al., 2011)“.