Toxigene Vibrio cholerae Evolution und Etablierung von Reservoiren in aquatischen Ökosystemen
Ergebnisse
Vier Departements – Aribonite, Centre, Nord-Ouest und Ouest – sind für 90 % der gemeldeten Cholerafälle in Haiti verantwortlich (9). Wir konzentrierten unsere Bemühungen auf das Departement Ouest (Abb. 1A), eine Küstenregion mit vielen aquatischen Ökosystemen, in der wir toxigene V. cholerae O1 aus festen Fluss- und Mündungsgebieten isoliert haben (Abb. 1A). Die Prävalenz von toxigenem aquatischem V. cholerae O1 korrelierte mit erhöhter Temperatur und Niederschlägen, nicht aber mit der Anzahl fäkalcoliformer Bakterien, was darauf hindeutet, dass das Vorkommen nicht allein auf fäkale Kontamination zurückzuführen ist (10). Die monatlichen Fallzahlen in Ouest, die jährlich oszillieren, aber während der Trockenzeit abnehmen und während der Regenzeit (April bis Oktober) zunehmen, korrelierten mit der Zunahme von Temperatur und Niederschlag (Abb. 1B). Dies stimmt mit den Mustern endemischer V. cholerae O1 in Bangladesch und Peru überein, wo saisonale Choleraausbrüche mit einer Zunahme von V. cholerae O1 in der Umwelt und einem Anstieg der Wassertemperatur oder der Niederschläge korrelieren (11, 12).
Um zwischen Evolution unter selektivem Druck (Anpassung) oder genetischer Drift zu unterscheiden, berechneten wir das Verhältnis der nicht-synonymen (dN) und synonymen Substitutionsraten (dS) (SI-Anhang, Abb. S6 und Tabelle S5). Die Evolutionsdynamik der klinischen Isolate wurde hauptsächlich durch reinigende Selektion (dN/dS = 0,6, P < 0,001) angetrieben, was mit einem negativen Tajima’s D (-2,3, P < 0,005) und einer Population, die Engpässe und/oder selektive Sweeps erlebt, übereinstimmt. Es wird erwartet, dass negative Selektion die bereits etablierte Epidemie beim Menschen antreibt, die in der adaptiven Landschaft während einer frühen Epidemiephase, die durch diversifizierende Selektion angetrieben wird, einen Höhepunkt erreicht hat (14). Im Gegensatz dazu wiesen Isolate aus der Umwelt größere nicht-synonyme Raten auf (dN/dS = 2,1, P < 0,001), was für eine heterogene mikrobielle Population charakteristisch ist, die vor kurzem in eine neue Umgebung eingeführt wurde und die Fixierung einer neuen variantengetriebenen diversifizierenden Selektion durchläuft. Tatsächlich fanden wir in den Genomen von V. cholerae, die sich erfolgreich replizierten und in der aquatischen Umwelt überlebten, umweltspezifische molekulare Abdrücke. Insgesamt sieben nicht-synonyme Mutationen in kodierenden Regionen, die der Umweltpopulation von V. cholerae möglicherweise einen Selektionsvorteil verschaffen, traten zwischen 2012 und 2015 entlang des Rückgrats der Umweltisolat-Phylogenie auf (Abb. 3 und SI-Anhang, Tabelle S7). Drei umweltbedingte Mutationen, zwei früh in der Verzweigung des Rückgrats (Abb. 3) und eine in einem internen Zweig (SI-Anhang, Tabelle S7), betrafen Gene des Typ-II-Sekretionssystems (TSSII): die allgemeinen Sekretionswegproteine A und G sowie K (SI-Anhang, Tabelle S7). Das TSSII spielt eine zentrale Rolle für die Virulenz und das Überleben von V. cholerae in verschiedenen Nischen, z. B. in aquatischen Reservoirs oder menschlichen Wirten (26). Andere Mutationen, die entlang interner Verzweigungen gefunden wurden, betrafen Gene, die mit der Reaktion auf Umweltstress, der Chemotaxis/Motilität von V. cholerae als Reaktion auf fluktuierende Umweltreize, der Kontrolle der Geißelhakenlänge, der Biofilmbildung in der extraintestinalen Umgebung und dem exponentiellen Wachstum als Reaktion auf verfügbare Nährstoffe zusammenhängen (SI-Anhang, Abb. S7 und Tabelle S7). Umweltisolate, die erfolgreich zur sich entwickelnden Umweltlinie beitrugen, wurden nicht nur in der Nähe von Krankenhäusern und Cholera-Behandlungszentren in Gressier gesammelt, sondern auch in den nahe gelegenen Regionen Goave und Carrefour (Abb. 3).
Evolution und Anpassung von V. cholerae in haitianischen Wasserreservoirs. Phylogenetische Beziehung und geografische Verteilung von 27 Umweltisolaten, die zwischen 2012 und 2015 in Haiti gesammelt wurden. Nicht-synonyme Mutationen, die während der Evolution der Umweltpopulation erworben wurden und durch Bayes’sche Inferenz von Vorfahren rekonstruiert wurden, sind entlang des Rückgrats des Baums angegeben. Die SNPs, die entlang des Stamms (überlebende Linie) des Baums entdeckt wurden, wurden von 1 bis 7 durchnummeriert, um den Vergleich mit den zusätzlichen Informationen im SI-Anhang, Tabelle S7, zu erleichtern. Die Karten zeigen die Probenahmestellen, gruppiert nach aquatischer Quelle, mit gelben, roten, orangefarbenen und cyanfarbenen Punkten in der Region Gressier, violett für Carrefour und blau in der Region Jacmel.
Die Hinweise auf epidemiologische und umweltbedingte evolutionäre Kräfte, die die haitianische Epidemie antreiben, haben uns dazu veranlasst, ein dynamisches Modell der Cholera-Übertragung und der Populationsgenetik durch aquatische Umgebungen und Wirte zu betrachten. Wie in früheren Choleramodellen unserer Gruppe (27) basiert unser zugrunde liegendes epidemiologisches Modell auf dem SIRW-Modell (susceptible-infected-recovered with reservoir), einer Erweiterung des klassischen SIR-Modells (susceptible-infected-recovered) mit einem zusätzlichen Kompartiment für die Erregerkonzentration in einem aquatischen Reservoir (W) (Abb. 4 und SI-Anhang, Abb. S8 und S9). In Übereinstimmung mit Kirpich et al. (27) berücksichtigten wir die Replikation außerhalb des Wirts sowie saisonale Schwankungen bei der Übertragung in der Umwelt, der Ausscheidung und dem Verfall, wie die signifikante Korrelation der Fallzahlen mit den Niederschlägen nahelegt. Zusätzlich zu dieser epidemiologischen Formulierung haben wir in unserem Modell eine evolutionäre Komponente berücksichtigt. Sowohl die neutrale Drift als auch der Selektionsdruck werden in unserem Multilocus-Rahmen berücksichtigt, wobei wir Ne durch die Berechnung der genetischen Vielfalt und die Verwendung von Koaleszenzansätzen messen (SI-Anhang, Text). In Übereinstimmung mit anderen Studien haben wir für Loci, die der Selektion unterliegen, einen Kompromiss zwischen der Überlebensfähigkeit in der Umwelt und der Fitness bei der Wirtsübertragung angenommen. Die Ergebnisse der Modellsimulationen entsprechen den qualitativen Merkmalen von Ne und den monatlichen Fallzahlen (Abb. 4A und SI-Anhang, Abb. S8).
Mixed-Transmission-Modell der Cholera und Vorhersage der Impfung. (A) Ne (effektive Populationsgröße) beobachtet aus Daten (grau) und in der Simulation mit Umweltreplikation (grün) und Ne in der Simulation ohne Umweltreplikation (violett). (B) Verschiedene Impf- und Kontrollszenarien für die Modellsimulation mit Umweltreplikation, insbesondere Impfabdeckungen von 64% (Rate von 0,01 d-1), 88% (Rate 0,04 d-1) und 64% bei einer 10%igen Erhöhung der Umweltzerfallsrate. Hier definieren wir den Impfschutz als die prozentuale Verringerung der anfälligen Individuen (nach Erreichen eines ungefähren Gleichgewichtszustands nach 2 bis 3 Monaten Impfung). Im Gegensatz zu Kirpich et al. (27) und Simulationen ohne Umweltreplikation (SI-Anhang, Abb. S10), bei denen 64 % Impfabdeckung den Erreger innerhalb eines Jahres ausrottet, sind hier entweder mehr Impfungen (88 % Abdeckung) oder ein erhöhter Umweltzerfall (10 % Erhöhung) erforderlich, um die Cholera bei Vorhandensein von Umweltreplikation zu kontrollieren.
Zunächst zeigen sowohl die Ergebnisse des Modells als auch die Daten einen Anstieg und ein Abfallen von Ne, was zunächst auf eine rasche Ausbreitung gefolgt von einer negativen Selektion nach dem ersten Ausbruch hindeutet (Abb. 4A). Dann wurde 2013 ein zweiter Anstieg von Ne beobachtet, dessen Ausmaß größer war, als durch die Übertragung durch den Wirt allein zu erwarten gewesen wäre, und der durch ein vorangegangenes saisonales Aufflackern hervorgerufen wurde und in eine Periode mit geringerer Inzidenz überging. Unsere Hypothese der Diversifizierung innerhalb des aquatischen Reservoirs bietet eine Erklärung für diesen relativen Anstieg von Ne und wird durch vernünftige Modellsimulationen unterstützt, bei denen die Einbeziehung der Umweltreplikation diese evolutionäre Erkundung im Gegensatz zu Fällen ohne Umweltreplikation ermöglicht (Abb. 4A und SI-Anhang, Abb. S8). Insbesondere während des Peaks von Ende 2012 bis Mitte 2013 wurden uuSNPs in den folgenden Genen der überlebenden Umweltlinie nachgewiesen: Vch1786_I0012 (1 C→T), Vch1786_I0051 (3 C→T), Vch1786_I0998 (30 G→A), Vch1786_I1539 (44 A→G), rseA (52 G→A), epsG (61 A→C) und Vch1786_II0794 (107 C→A) (SI Appendix, Fig. S3). Mutationen in diesen Genen könnten zu einer verstärkten Anpassung von Umweltstämmen im aquatischen Ökosystem beigetragen haben, obwohl zukünftige In-vitro-Studien erforderlich sind, um ihren Beitrag zur Fitness von V. cholerae zu untersuchen. Auf den Höhepunkt der Replikation in der Umwelt folgt ein erheblicher Rückgang von Ne, der vor der großen Flaute im Jahr 2014 begann. Auch hier lässt sich das Ausmaß dieses Rückgangs nicht vollständig durch die Häufigkeit der Fälle erklären. Während der Populationsengpass zu einem Rückgang von Ne führt, deuten Simulationen darauf hin, dass die Umweltvermehrung notwendig ist, um die Fixierung von Genen zu beschleunigen, die an das Fortbestehen im Wasserreservoir angepasst sind. Ende 2014 greifen die Umweltreservoire auf die Wirte über, was zu einem sprunghaften Anstieg der klinischen Fälle führt, möglicherweise verstärkt durch eine günstige Anpassung der Wirte und/oder den Verlust der Immunität in der Wirtspopulation. Ausführliche Simulationen, die an den Falldaten kalibriert wurden, legen nahe, dass die Replikation in der Umwelt in das Modell einbezogen werden sollte, um die beobachteten Ne-Fälle zusätzlich zu berücksichtigen. Eine wichtige Auswirkung unserer Ergebnisse ist, dass die Replikation und Anpassung innerhalb des aquatischen Reservoirs Kontrollstrategien, die auf die Übertragung durch den Wirt abzielen, erschweren könnten. In der Tat haben wir in Simulationen ab 2015 beobachtet, dass eine Impfung den Erreger ohne Replikation in der Umwelt leicht beseitigen kann (SI-Anhang, Abb. S10). Für eine Umweltanpassung und Replikation, die mit dem beobachteten Ne übereinstimmt, ist jedoch die Impfung eines viel größeren Teils der Bevölkerung oder eine zusätzliche Intervention, die das aquatische Reservoir betrifft, erforderlich, um die Cholera in unserem dynamischen Modell mit gemischter Übertragung zu eliminieren (Abb. 4B).