Transmigrierte Neutrophile im Darmlumen setzen ICAM-1, um die epitheliale Barriere und die Neutrophilenrekrutierung zu regulieren

Transmigrierte Neutrophile im Darmlumen setzen ICAM-1, um die epitheliale Barriere und die Neutrophilenrekrutierung zu regulieren

ICAM-1 fördert die Adhäsion und Fortbewegung von PMN an der apikalen Epithelmembran unter Entzündungsbedingungen

In Kryptenabszessen, wie sie bei aktiver IBD zu beobachten sind, werden PMN, die in die Darmkrypten eindringen, häufig in engem Kontakt mit der apikalen (luminalen) Epitheloberfläche beobachtet.14 Um die Interaktionen zwischen PMN und IEC in den späten Stadien der TEM zu untersuchen, haben wir die PMN-Migration durch das Darmepithel unter entzündlichen Bedingungen mit Hilfe eines zuvor beschriebenen Transwell-Aufbaus modelliert.19 Die TEM von PMN in der physiologischen Richtung von basolateral nach apikal durch kontrollierte oder mit Interferon-γ (IFNγ) behandelte T84-IECs wurde durch Zugabe eines transepithelialen N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF)-Gradienten (100 nM) ausgelöst. Die Exposition von T84-IECs gegenüber IFNγ (100 U ml-1, 24 h) hatte keinen signifikanten Effekt auf die IEC-Barrierefunktion oder die Expression und subzelluläre Lokalisierung der wichtigen JAM-A-, Occludin- und ZO-1-Proteine (ergänzende Abbildung S1 online). Die IFNγ-Behandlung hatte keine signifikante Auswirkung auf die Anzahl der PMN, die das TEM abschlossen; sie erhöhte jedoch signifikant die Anzahl der apikal assoziierten PMN (von 8,7±1,8%, unbehandelt, auf 19,7±1,9%, IFNγ, apikal, Abbildung 1a). Im Einklang mit diesem Anstieg war die Zahl der nicht migrierten PMN (PMN in der oberen Kammer, basal) nach der IFNγ-Behandlung signifikant reduziert (∼1,5-fach), was auf eine erhöhte Migrationsrate schließen lässt (Abbildung 1a). Die Anzahl der PMN innerhalb der epithelialen Monoschicht (Epith) war nicht verändert. Repräsentative konfokale Immunfluoreszenzbilder (Abbildung 1b, obere Felder) und z-Projektionen (untere Felder) zeigen apikal assoziierte PMN nach der Migration durch IFNγ-stimulierte, aber nicht durch Kontroll-T84-Monolayer. Da IFNγ nachweislich die Expression von ICAM-1 in entzündetem Epithel induziert,27 stellten wir die Hypothese auf, dass während der Entzündung PMN, die durch epitheliale Monoschichten wandern, durch Mac-1- und ICAM-1-abhängige Interaktionen an der apikalen Membran haften bleiben und daher zu einer ICAM-1-abhängigen Fortbewegung fähig sind, wie sie zuvor im vaskulären Endothel beobachtet wurde.24, 28 Zur Bestätigung früherer Ergebnisse induzierte die IFNγ-Behandlung (100 U ml-1, 24 h) einen robusten, zeitabhängigen Anstieg der ICAM-1-Expression (Höhepunkt 24 h nach der Behandlung, Abbildung 1c,d) auf der apikalen Membran von T84 IECs (Abbildung 1e). Dieser Effekt war spezifisch für IFNγ, da die Exposition von T84- und SKCO15-IECs mit Tumornekrosefaktor-α (TNFα; 10 ng ml-1) keine ICAM-1-Expression induzierte (ergänzende Abbildung S2A,B). Eine Hochregulierung von ICAM-1 wurde auch im Kryptenepithel von Kolonbiopsien von Patienten mit aktiver Colitis ulcerosa im Vergleich zur gesunden Mukosa beobachtet (Abbildung 1f). Die Bestätigung der ICAM-1- und Mac-1-abhängigen PMN-Adhäsion an apikalen IEC-Membranen erfolgte durch die Zugabe von Anti-ICAM-1- oder Anti-Mac-1-Antikörpern (Abs; 20 μg ml-1), die die IFNγ-induzierte Zunahme der PMN-Adhäsion aufhoben (ergänzende Abbildung S3A). Interessanterweise führte die Hemmung von PMN-Mac-1 zu einer stärkeren Reduktion (>3-fach) der PMN-Adhäsion als die Hemmung von ICAM-1, was darauf hindeutet, dass Mac-1 neben ICAM-1 auch andere Liganden der Epitheloberfläche bindet.

Als Nächstes untersuchten wir, ob apikal adhärierte PMN nach dem Durchqueren des Epithels eine apikale Fortbewegung zeigen. Mit Hilfe der Phasenkontrast-Zeitraffermikroskopie wurde das Verhalten einzelner PMN, die an der apikalen IEC-Membran haften, verfolgt und quantifiziert. In Abwesenheit eines exogenen Stimulus bewegten sich die PMN kaum; 59,3±7,6 % der apikal assoziierten PMN zeigten jedoch nach der Migration durch die IECs ein hochgradig bewegliches Verhalten (Abbildung 2a) mit durchschnittlichen Kriechstrecken von 65,6±6,2 μm (Abbildung 2b). Die TEM induzierte einen starken Anstieg der Mac-1-Expression auf der PMN-Zelloberfläche (Abbildung 2c), was mit seiner Rolle bei den apikalen PMN-IEC-Interaktionen übereinstimmt. Wichtig ist, dass die Anzahl der PMN, die eine apikale Fortbewegung zeigten, signifikant erhöht war, wenn IECs mit IFNγ stimuliert wurden, um ICAM-1 hochzuregulieren (88±3,6%, IFNγ, vs. 59,3±7,6%, unbehandelte IEC). Unter diesen Bedingungen legten die PMN deutlich längere Strecken (101±10,0 μm, IFNγ, vs. 65,6±6,2 μm, unbehandelte IECs, Abbildung 2b) entlang der apikalen Epithelmembran zurück. Die Rolle von ICAM-1 bei der Vermittlung der PMN-Lokomotion wurde durch die Zugabe eines funktionsblockierenden Anti-ICAM-1-Antikörpers (Ab) bestätigt, der die IFNγ-Effekte aufhob und sowohl die Anzahl als auch die von den PMN zurückgelegten Entfernungen reduzierte (61,4±7,8 % bzw. 73,6±6,1 μm, Abbildung 2a,b). Die Hemmung von Mac-1 hob die Fortbewegung der verbleibenden adhärenten PMN auf (Abbildung 2a und ergänzende Filme S1 und S2), was eine exklusive Rolle von Mac-1 in diesem Prozess bestätigt. Die Auswirkungen der Mac-1-Inhibition auf die PMN-Lokomotion werden in Zeitraffer-Bildsequenzen (Abbildung 2d) und durch Verschiebungstrajektorien von sechs repräsentativen PMN (Abbildung 2e) weiter verdeutlicht. Die Kriechgeschwindigkeiten der PMN reichten von 3 bis 7 μm min-1 und unterschieden sich nicht signifikant auf unstimulierten vs. IFNγ-stimulierten IECs (ergänzende Abbildung S3B).

PMN-Adhäsion an der apikalen Epithelmembran beeinträchtigt die epitheliale Barrierefunktion

Als nächstes untersuchten wir die Auswirkungen von PMN-Interaktionen mit apikal exprimierten epithelialen Liganden auf die epitheliale Barrierefunktion. In diesen Experimenten wurden PMN apikal zu konfluierenden T84 IECs hinzugefügt, die auf permeablen Trägern (0,4 μm Porengröße, zu klein für PMN TEM) kultiviert wurden, und TER, als Index der Epithelbarriere, wurde über 12 Stunden unter festgelegten Bedingungen gemessen. Der Zeitraum von 12 Stunden wurde gewählt, um die Auswirkungen apoptotischer PMN auf die Epithelbarriere zu vermeiden.29 fMLF (100 nM)-stimulierte PMN-Adhäsion an T84-IECs löste eine zeitabhängige Abnahme der TER über einen Zeitraum von 12 Stunden aus (∼60%, Abbildung 3a). Wichtig ist, dass die Zugabe von PMN zur apikalen Membran von T84-IECs, die mit IFNγ vorbehandelt wurden, was, wie wir gezeigt haben, zu einer verstärkten ICAM-1-abhängigen PMN-Adhäsion führt (Abbildung 1a), zu einer weiteren Abnahme der TER führte (∼40% in den ersten 2 Stunden und ∼90% über 12 Stunden). Die IFNγ-Behandlung allein hatte keine Auswirkungen auf die TER. Um zu testen, ob der beobachtete Anstieg der Epithelpermeabilität auf einen direkten Kontakt zwischen Epithelzellen und PMN zurückzuführen ist, verwendeten wir ein anti-Mac-1 hemmendes Ab (CBRM1/29, 20 μg ml-1), um die PMN-Adhäsion an IFNγ-stimulierten IECs zu hemmen. Die Hemmung von Mac-1 schwächte die PMN-induzierte Abnahme der TER nach IFNγ-Stimulation deutlich ab (Abbildung 3a). In separaten Experimenten konnten wir bestätigen, dass die PMN-induzierte Abnahme der TER sowohl in unstimulierten als auch in IFNγ-behandelten Epithelmonolayern vom direkten Kontakt zwischen PMN und der apikalen Epithelmembran abhängt und nicht durch parakrine Mechanismen vermittelt wird. In solchen Experimenten wurden PMNs in die untere Kammer von Transwells mit umgedrehten (apikale Seite nach unten) T84-Monolayern gegeben und mit fMLF (100 nM) stimuliert. Unter diesen Bedingungen gab es keine Auswirkungen der PMN auf die Epithelbarriere, wie durch TER (Abbildung 3b) festgestellt wurde. Die Exposition von Epithelmonolayern gegenüber 100 nM fMLF für 12 Stunden hatte keine signifikante Auswirkung auf TER.

Die Bindung von epithelialem ICAM-1 löst eine MLCK-abhängige Erhöhung der intestinalen Epithelpermeabilität aus

Wir beobachteten, dass die apikale Hochregulierung von ICAM-1 die Auswirkungen der Mac-1-abhängigen PMN-Adhäsion auf die Epithelbarriere deutlich verstärkte (Abbildung 3a). Wir stellten daher die Hypothese auf, dass die PMN-induzierte Erhöhung der Permeabilität von IFNγ-behandelten Epithelmonolayern auf die durch den Kontakt mit PMN vermittelte ICAM-1-Anhäufung und die Induktion von ICAM-1-abhängigen Signalereignissen zurückzuführen ist, wie sie zuvor im vaskulären Endothel beschrieben wurden.30, 31 T84-IEC-Monolayer auf durchlässigen Trägern wurden mit IFNγ behandelt, um die ICAM-1-Expression zu induzieren, und anschließend mit vernetzenden Abs gegen ICAM-1 versehen. Wir bestätigten, dass die Ab-vermittelte Vernetzung die ICAM-1-Clusterbildung induzierte (ergänzende Abbildung S2C). Wie in Abbildung 4a gezeigt, führte die Ab-vermittelte Vernetzung von ICAM-1 zu einer zeitabhängigen Abnahme der TER, die mit einem erhöhten parazellulären Fluss von Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-Dextran (3 kDa, Abbildung 4b) korrelierte. Dieser Effekt war spezifisch für ICAM-1, da die Vernetzung anderer epithelialer Oberflächenmoleküle, des Haupthistokompatibilitätskomplexes-1 (MHC-1; Abbildung 4) und des bekannten PMN-Liganden CD55 (ergänzende Abbildung S5) keine signifikanten Auswirkungen auf die Permeabilität hatte. In Übereinstimmung mit der fehlenden ICAM-1-Expression auf unstimulierten T84-IECs hatte die Applikation von vernetzendem Abs auf die apikale Oberfläche dieser IECs in Abwesenheit von IFNγ-Stimulation keinen Effekt auf TER (ergänzende Abbildung S4A). In Übereinstimmung mit der IFNγ-induzierten ICAM-1-Lokalisierung auf der apikalen Epithelmembran hatte die Anwendung von vernetzenden Abs auf die basolaterale Seite von Epithelmonolayern ebenfalls keine signifikante Auswirkung auf die Barrierefunktion (ergänzende Abbildung S4B).

Wir haben bereits gezeigt, dass frühe Ereignisse in der PMN-TEM (auf der Ebene der basolateralen Epithelialmembran) MLCK-vermittelte Abnahmen der TER auslösen.9 Es hat sich gezeigt, dass MLCK eine Schlüsselrolle bei der Regulierung der epithelialen Permeabilität spielt, indem es die Kontraktion des perijunktionalen Aktomyosinrings durch die Phosphorylierung der regulatorischen leichten Kette von Myosin II reguliert.32 Wir fragten uns daher, ob die erhöhte IEC-Permeabilität nach Ligation von apikal exprimiertem ICAM-1 von MLCK abhängig ist. Tatsächlich führte die Ab-vermittelte Vernetzung von ICAM-1 zu einer MLCK-Phosphorylierung (Tyr 464), was einer MLCK-Aktivierung entspricht (Abbildung 4c). Diese Aktivierung ging mit einer Verringerung der apikalen Bürstenleiste und des perijunktionellen F-Actins einher (Abbildung 4d), was auf eine Reorganisation des Aktinzytoskeletts hindeutet. Wichtig ist, dass die Hemmung der durch ICAM-1-Ligation induzierten MLCK-Phosphorylierung in T84-Zellen mit ML-7 (20 μM,33 ergänzende Abbildung S4C) die ICAM-1-induzierte F-Aktin-Reorganisation (Abbildung 4d), die Abnahme der TER (Abbildung 4a) und den Anstieg des parazellulären Dextranflusses (Abbildung 4b) verhindert. Die ML-7-Behandlung (20 μM) allein hatte keine Auswirkungen auf TER. Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass unter entzündlichen Bedingungen der Kontakt von PMN mit der apikalen Oberfläche von Kryptenepithelzellen ICAM-1-abhängige Signalereignisse auslöst, die zu einer erhöhten Permeabilität führen.

Die Bindung von ICAM-1 an die apikale Epithelmembran erleichtert die verstärkte TEM von PMN

Da die Ligatur von apikal exprimiertem ICAM-1 die epitheliale Permeabilität erhöht, führten wir Experimente durch, um zu untersuchen, ob ICAM-1-abhängige Veränderungen der epithelialen Barrierefunktion zu einer verstärkten TEM von PMN führen würden. Zunächst untersuchten wir, ob die Bindung der PMN an ICAM-1 auf der apikalen IEC-Membran die TEM der PMN in der physiologisch relevanten Richtung von basolateral nach apikal beeinflusste.34 In diesen Experimenten wurden die PMN zur Migration durch Epithel-Monolayer stimuliert, die transmigrierten Zellen wurden gesammelt und für 1 h auf die apikale Oberfläche neuer Epithel-Monolayer (2,5 × 105 PMN pro Monolayer) mit oder ohne IFNγ-Vorbehandlung aufgetragen. Nach 1 h PMN-Epithel-Kontakt wurden die Monoschichten von adhärenten PMN befreit und für anschließende PMN-TEM-Tests in basolateraler bis apikaler Richtung verwendet. Die apikale Einführung von PMN in IFNγ-behandelte, aber nicht in unbehandelte Epithelmonoschichten löste einen signifikanten Anstieg der PMN-TEM aus (1,7-fach, Abbildung 5a). Eine IFNγ-Behandlung allein oder die Anwesenheit von PMN in der Nähe der apikalen Oberfläche, jedoch ohne direkten Kontakt mit den Monolayern, hatte keine Auswirkungen auf die PMN-TEM (Abbildung 5a). In parallelen Experimenten wurde das TEM von PMN nach spezifischer Ab-vermittelter Vernetzung von ICAM-1 untersucht. Im Einklang mit der Wirkung der ICAM-1-Vernetzung auf die IEC-Barrierefunktion erhöhte die Ab-vermittelte Vernetzung von ICAM-1 auf IFNγ-behandelten T84 IECs das PMN-TEM signifikant (1,9±fach, Abbildung 5b) im Vergleich zur Vernetzung eines apikal exprimierten Kontrollmoleküls, MHC-1. Wie erwartet hatte die Anwendung von ICAM-1-Vernetzungsprotokollen auf unbehandelte IEC-Monolayer keine signifikante Auswirkung auf das PMN-TEM. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass PMN, die an der apikalen (luminalen) IEC-Membran durch die Bindung von ICAM-1 adhärieren, Veränderungen in der epithelialen Barrierefunktion auslösen und zur Regulierung der PMN-Rekrutierung beitragen können.

Die ICAM-1-Vernetzung führte zu einer MLCK-Aktivierung, was auf eine Aktin-Myosin-Kontraktion schließen lässt (Abbildung 4). Daher untersuchten wir als Nächstes die Auswirkungen der MLCK-Hemmung und der Hemmung der kontraktilen F-Aktin-Kräfte auf die PMN-TEM nach ICAM-1-Vernetzung. Die durch die ICAM-1-Vernetzung induzierte erhöhte PMN-TEM wurde umgekehrt, wenn die IECs entweder mit dem MLCK-Inhibitor ML-7 (20 μM, 1 h33) oder dem Myosinmotor-II-Inhibitor Blebbistatin (10 μM, 1 h,35 Abbildung 5c) vorbehandelt wurden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Aktomyosinkontraktion stromabwärts von ICAM-1 bei der Regulierung der PMN-TEM eine Rolle spielt. Die Behandlung mit ML-7 oder Blebbistatin allein hatte keine Auswirkung auf das TEM der PMN (Abbildung 5c).

Die körpereigene Ligatur von ICAM-1 im Darmlumen von Mäusen führt zu einer MLCK-abhängigen Erhöhung der epithelialen Permeabilität und einer verstärkten Rekrutierung von PMN

Als nächstes führten wir In-vivo-Experimente durch, um die Auswirkung der ICAM-1-Ligatur auf die Barrierefunktion des Darmepithels und die Rekrutierung von PMN zu untersuchen, wobei wir ein Maus-Darmschlingenmodell verwendeten (Abbildung 6b). In diesem Modell wurde die Permeabilität von intakten, blutdurchströmten Dünndarmsegmenten nach Einführung von FITC-Dextran in das Darmlumen untersucht. Wie in Abbildung 6a dargestellt, wurde ICAM-1 zwar im nicht stimulierten Epithel nicht nachgewiesen (oberes Feld), aber die intraperitoneale (i.p.) Verabreichung von IFNγ und TNFα (500 ng, 24 h) führte zu einer starken Induktion der ICAM-1-Expression. Insbesondere lokalisierte sich das induzierte ICAM-1 in den apikalen Regionen der murinen Krypta-IECs oberhalb von Claudin-2 (Abbildung 6a, unteres Feld). Parallel dazu beobachteten wir, dass die Zytokinbehandlung zu einer ∼2-fachen Erhöhung der Permeabilität des 3-kDa-FITC-Dextrans führte (Abbildung 6c).

Wichtig ist, dass die Einführung von ICAM-Vernetzungs-Abs, nicht aber von Abs für das Kontrollprotein MHC-1 in das Lumen von Zytokin-stimulierten Darmschlingen eine weitere ∼1,5-fache Erhöhung der Permeabilität für Dextran im Vergleich zur Zytokinbehandlung allein bewirkte (Abbildung 6c). Um zu bestätigen, dass die Erhöhung der intestinalen Epithelpermeabilität spezifisch durch epitheliale ICAM-1-induzierte Signalereignisse vermittelt wird, verwendeten wir Peptide, die von der zytoplasmatischen Domäne von ICAM-1 (ICAM-1-Peptid) abgeleitet sind, um die Fähigkeit von ICAM-1 zu hemmen, nachgeschaltete Signalereignisse zu vermitteln. In vaskulärem Endothel konnte bereits gezeigt werden, dass ICAM-1, aber nicht das Kontrollpeptid, die Wechselwirkungen zwischen ICAM-1 und Zielproteinen hemmt und damit die ICAM-1-abhängige Signalübertragung verhindert, ohne die Bindung an extrazelluläre Leukozytenliganden zu beeinträchtigen.22, 24 Die Zugabe von ICAM-1, aber nicht des Kontrollpeptids (100 μg ml-1, 30 min), hemmte die durch ICAM-1-Ligatur induzierte Erhöhung der intestinalen Permeabilität (Abbildung 6c). Es wurde bestätigt, dass Abs, die intraluminal in Darmschlingen (unstimuliert und nach IFNγ/TNFα-Aktivierung) eingebracht wurden, das Epithel nicht durchqueren, so dass ein möglicher indirekter Beitrag von Lamina-propria-Zellen zu den beobachteten Effekten ausgeschlossen werden kann (ergänzende Abbildung S6).

Eine weitere Unterstützung für die Rolle von MLCK bei der ICAM-1-vermittelten Signalübertragung bot die Hemmung der MLCK-Aktivierung mit ML-7 (1 mg kg-1, i.p.36) vor der ICAM-1-Vernetzung verhinderte die Zunahme der Permeabilität (Abbildung 6c). Diese Daten zeigen, dass eine erhöhte intestinale Epithelpermeabilität in vivo nach ICAM-1-Ligatur von MLCK abhängig ist.

Da eine erhöhte epitheliale Permeabilität mit einer verstärkten PMN-Migration einhergeht, stellten wir die Frage, ob eine Ligatur von ICAM-1 zu einer verstärkten PMN-Rekrutierung in vivo führen würde. Mit Hilfe des murinen Darmschlingenmodells wurde die PMN-Infiltration in die Darmschleimhaut und die Migration in das Lumen durch die Verabreichung des Chemoattraktivums CXCL1 (1 μM in 200 μl Hank’s balanced salt solution (HBSS)+) induziert und durch Immunfluoreszenzmarkierung/konfokale Mikroskopie und Analyse der auf Zytospins präparierten und mit Diff-Quik gefärbten Lavageflüssigkeit quantifiziert. In Abwesenheit des Chemoattraktanten wurden PMNs weder im Darmepithel noch im Darmlumen nachgewiesen (nicht gezeigt); die Verabreichung von CXCL1 aus dem Darm löste jedoch eine signifikante PMN-Migration in die Epithelschicht (Abbildung 7a) und eine Akkumulation im Darmlumen aus (Abbildung 7c). In Übereinstimmung mit dem zytokininduzierten Anstieg der Permeabilität erhöhte die IFNγ/TNFα-Behandlung die Anzahl der PMN im Darmepithel um das ∼2,2-fache und im Lumen um das ∼1,7-fache. Wichtig ist, dass die Zugabe von ICAM-1 vernetzendem Abs in das Lumen von mit Zytokin behandelten Darmschlingen die Anzahl der PMN sowohl im Epithel (∼1,6-fach, Abbildung 7a,b) als auch im Lumen (∼1,4-fach, Abbildung 7c,d) weiter erhöhte (im Vergleich zur Zytokinbehandlung allein). PMN (grün), die das Darmepithel (rot) infiltrieren, sind in repräsentativen Bildern von Gewebeschnitten aus zytokinaktivierten Darmschlingen nach ICAM-1-Ligatur dargestellt (Abbildung 7b). Ebenso sind PMN, die nach ICAM-1-Ligatur in das Lumen eingewandert sind, in repräsentativen Bildern von Spülflüssigkeiten aus Darmschlingen dargestellt (Abbildung 7d).

In Übereinstimmung mit den durch ICAM-1-Ligatur induzierten Erhöhungen der epithelialen Permeabilität war die verstärkte PMN-Migration in das Darmlumen von ICAM-1-vermittelten Signalereignissen und MLCK-Aktivierung abhängig. Sowohl die intraluminale Zugabe des ICAM-1-Peptids, nicht aber des Kontrollpeptids (nicht gezeigt; 100 μg ml-1, 30 min), als auch die Hemmung von MLCK (ML-7, 1 mg kg-1, i.p.) vor der Ab-vermittelten Vernetzung von ICAM-1 hemmten die durch die ICAM-1-Ligation induzierte Zunahme der PMN-Migration vollständig (Abbildung 7a,c). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Bindung von ICAM-1 an die apikale intestinale Epithelmembran unter Entzündungsbedingungen die Barrierefunktion beeinträchtigt und so eine verstärkte Rekrutierung von PMN in vivo erleichtert.