Deuterated Chloroform
13.4.4 Beoordeling en onderhoud van de prestaties van het instrument
Om opneming van laboratoriuminstrumenten in kwaliteitsbeheersystemen die worden gebruikt voor laboratoriumcertificeringen (d.w.z. ISO17025 voor analytische laboratoria) is het nodig de prestaties van het instrument met regelmatige tussenpozen te beoordelen en te onderhouden. Deze certificeringen stellen de analytische laboratoriumwetenschapper in staat bedrijfskwalificatie- (OQ) en prestatiekwalificatietests (PQ) op te zetten rond het beoogde gebruik van het instrument. Voor NMR kunnen de OQ/PQ-tests dus variëren naar gelang van de gangbare analytische tests die op het instrument moeten worden uitgevoerd. Moderne instrumenten hebben automatische procedures waarbij de gebruiker het geschikte monster moet inbrengen, waarna op geautomatiseerde wijze een reeks tests wordt uitgevoerd. Aan het eind van deze tests wordt een rapport afgegeven aan de hand waarvan de gebruiker de algehele prestaties van de spectrometer kan beoordelen.
Voor het testen van eiwittherapeutica in waterige oplossingen moeten deze OQ-tests het volgende omvatten: temperatuurkalibratie, linehape op het acetonsignaal in gedeuteriseerd chloroform, gevoeligheid op ethylbenzeensignalen in gedeuteriseerd chloroform en/of wateronderdrukking met gevoeligheidsbeoordeling op de anomere protonen van een 2 mM sucrose-oplossing. Temperatuurkalibratie is belangrijk omdat de dynamica van een eiwit wordt beïnvloed door de omgevingscondities van de oplossing, die grote effecten kunnen hebben op de waargenomen signaallijnbreedten en frequenties. De regeling van de temperatuur van het monster in NMR spectrometers is afhankelijk van een zorgvuldige regeling van de temperatuur en het debiet van de sonde-lucht. De invloed van de sonde lucht op de temperatuur van het monster kan worden gemeten door meting van de chemische verschuivingen van een 100% methanol of 100% ethyleenglycol oplossing. Deze verschuivingen zijn zorgvuldig gemeten, zodat de werkelijke monstertemperatuur kan worden beoordeeld bij een gegeven instelling van de temperatuur en het debiet van de sonde-lucht.
Het effect van een goede shimming van het monster (d.w.z. een uniform magnetisch veld over het waargenomen deel van een monster) op de spectrale kwaliteit kan niet worden overschat: hoe smaller de pieken, hoe beter de resolutie en gevoeligheid van de te meten signalen. Met name wanneer signaalonderdrukkingstechnieken worden gebruikt, geldt dat hoe smaller de basis van de te onderdrukken piek is, des te beter de voorverzadigings- of smalbandselectieve signaalonderdrukkingstechnieken zullen werken. Gelukkig heeft de komst van field-mapping technieken en gradiënt shimming deze vaak tijdrovende taak van het aanpassen van de shim-instellingen voor elk monster vereenvoudigd. Er zullen echter monsters zijn waarvoor de shim-kaarten niet goed werken, en er zal tijd moeten worden besteed aan het afstellen van de shim om een optimale respons van het instrument te krijgen.
Evaluatie van de gevoeligheid van de spectrometer met standaardmonsters is een ideale manier om de prestaties van het systeem te volgen en de uit de standaardtests verkregen waarden moeten voldoen aan de door de fabrikant vastgestelde specificaties van de spectrometer of deze overschrijden. De specificaties van de spectrometer worden door de fabrikant vaak op een conservatieve manier vastgesteld om er zeker van te zijn dat hun instrument deze tests bij de installatie doorstaat. Door de OQ/PQ-tests op gezette tijden uit te voeren kan de eigenaar van de spectrometer zich echter vertrouwd maken met de mogelijkheden van zijn instrument. Afwijkingen van de door routinetests vastgestelde waarden moeten zorgvuldig worden onderzocht, aangezien zij een aanwijzing kunnen zijn voor een slechte werking van het instrument.
In het geval van de analyse van kleine moleculen in organische oplosmiddelen leidt het gebruik van het acetonsignaal in geduterateerd chloroform om niet alleen een Lorentziaanse lijnvorm en een smalle FWHH te verkrijgen, maar ook een smalle basis (b.v. <20 Hz bij de 20% van het 13C-satellietsignaal) gewoonlijk tot de beste gevoeligheid voor ethylbenzeensignalen in geduterateerd chloroform. Voor spectrometers die worden gebruikt voor het verkrijgen van spectra in waterige oplossingen is een tweede gevoeligheidsmeting van groter belang: het vermogen van de spectrometer om een goede gevoeligheid en resolutie te verkrijgen van signalen in de buurt van de waterpiek. Zo is de meting van de gevoeligheid met de anomere protonensignalen van een standaard bestaande uit 2 mM sucrose in 95% H2O/5% D2O oplossing met toegepaste wateronderdrukking een realistischer maat voor de signaal-ruis prestaties van de spectrometer voor NMR van eiwithoudende therapeutische monsters.
Voor een PQ op een spectrometer die de kwaliteit van eiwithoudende therapeutica beoordeelt, is een kritisch kwaliteitsattribuut van deze geneesmiddelen een specifieke tertiaire structuur die door het vouwen van de aminozuurketen wordt aangebracht. Daarom kunnen als PQ op een spectrometer die 2D-structuurkaartanalyse uitvoert, 2D-HSQC-spectra in korte tijd worden uitgevoerd op een 15N- of 13C-isotopisch verrijkt monster om het vermogen van de spectrometer vast te stellen om pulsprogramma’s uit te voeren met efficiënte ontkoppelingsschema’s en gradiëntcoherentieselectie. 13C of 15N isotopisch verrijkt eiwit (bijvoorbeeld SH3-domein eiwit of ubiquitine) standaardoplossingen in verzegelde buizen zijn in de handel verkrijgbaar bij concentraties waarmee gegevens kunnen worden verzameld in een paar uur. Naar behoren gekalibreerde spectrometers op 500 MHz en hoger, en uitgerust met een cryo-probe kan meten 2D-structuur kaarten op natuurlijke abundantie (dat wil zeggen, niet isotopisch verrijkt) eiwitten op ∼1,0 mM concentratie in 2-3 dagen spectrometer tijd .