Evolución de Vibrio cholerae toxigénico y establecimiento de reservorios en ecosistemas acuáticos
Resultados
Cuatro departamentos -Artibonite, Centro, Noroeste y Ouest- representan el 90% de los casos de cólera registrados en Haití (9). Centramos nuestros esfuerzos en el departamento de Ouest (Fig. 1A), una región costera rica en ecosistemas acuáticos en la que hemos aislado V. cholerae O1 toxigénico en sitios fluviales y estuarinos fijos (Fig. 1A). La prevalencia de V. cholerae O1 toxigénico acuático se correlacionó con el aumento de la temperatura y las precipitaciones, pero no con los recuentos de coliformes fecales, lo que sugiere que la presencia no se debe únicamente a la contaminación fecal (10). Los recuentos mensuales de casos en Ouest, que oscilan anualmente pero que disminuyen durante la estación seca y aumentan durante la estación lluviosa (abril a octubre), se correlacionaron con el aumento de la temperatura y las precipitaciones (Fig. 1B). Esto concuerda con los patrones de V. cholerae O1 endémico en Bangladesh y Perú, donde los brotes estacionales de cólera se correlacionan con el aumento de V. cholerae O1 en el medio ambiente y el aumento de la temperatura del agua o las precipitaciones (11, 12).
Para distinguir entre la evolución bajo presión selectiva (adaptación) o deriva genética, calculamos la relación de tasas de sustitución no sinónima (dN) y sinónima (dS) (dN/dS) (Apéndice SI, Fig. S6 y Tabla S5). La dinámica evolutiva de los aislados clínicos fue impulsada principalmente por la selección purificadora (dN/dS = 0,6, P < 0,001), consistente con una D de Tajima negativa (-2,3, P < 0,005) y una población que experimenta cuellos de botella y/o barridos selectivos. Se espera que la selección negativa impulse la epidemia ya establecida en humanos que ha alcanzado un pico en el paisaje adaptativo durante una etapa epidémica temprana impulsada por la selección diversificadora (14). Por el contrario, los aislados ambientales mostraron mayores tasas de no sinónimos (dN/dS = 2,1, P < 0,001), características de una población microbiana heterogénea recientemente introducida en un nuevo entorno y sometida a la fijación de una nueva selección diversificadora impulsada por variantes. De hecho, encontramos huellas moleculares específicas del entorno en los genomas de V. cholerae que se replicaron y persistieron con éxito en el medio acuático. Un total de siete mutaciones no sinónimas en las regiones de codificación, que potencialmente otorgan una ventaja selectiva a la población ambiental de V. cholerae, surgieron a lo largo de la columna vertebral de la filogenia de los aislados ambientales entre 2012 y 2015 (Fig. 3 y Apéndice SI, Tabla S7). Tres mutaciones específicas del entorno, dos al principio de la bifurcación de la columna vertebral (Fig. 3) y una en una rama interna (Apéndice SI, Tabla S7), afectaron a los genes del sistema de secreción de tipo II (TSSII): proteínas generales de la vía de secreción A y G, y K (Apéndice SI, Tabla S7). El TSSII desempeña un papel fundamental en la virulencia y la supervivencia de V. cholerae en diferentes nichos, como los reservorios acuáticos o los huéspedes humanos (26). Otras mutaciones encontradas a lo largo de las ramas internas afectaron a genes relacionados con la respuesta al estrés ambiental, la quimiotaxis/motilidad de V. cholerae en respuesta a señales ambientales fluctuantes, el control de la longitud del gancho del flagelo, la formación de biopelículas en el entorno extraintestinal y el crecimiento exponencial en respuesta a los nutrientes disponibles (Apéndice SI, Fig. S7 y Tabla S7). Los aislados ambientales que contribuyeron con éxito a la evolución del linaje ambiental se recogieron no sólo cerca de los hospitales y centros de tratamiento del cólera situados en Gressier, sino también en las regiones cercanas de Goave y Carrefour (Fig. 3).
Evolución y adaptación de V. cholerae en los reservorios acuáticos de Haití. Relación filogenética y distribución geográfica de 27 aislados ambientales recogidos entre 2012 y 2015 en Haití. Las mutaciones no sinónimas adquiridas durante la evolución de la población ambiental, reconstruidas por inferencia bayesiana de los estados ancestrales, se indican a lo largo de la columna vertebral del árbol. Los SNPs detectados a lo largo del tronco (linaje superviviente) del árbol fueron numerados secuencialmente del 1 al 7 para facilitar la comparación con la información adicional reportada en el Apéndice SI, Tabla S7. Los mapas muestran los sitios de muestreo, agrupados por fuente acuática, etiquetados con puntos amarillos, rojos, naranjas y cian en la región de Gressier, púrpura para Carrefour y azul en la región de Jacmel.
La evidencia de las fuerzas evolutivas epidemiológicas y ambientales que impulsan la epidemia haitiana nos motivó a considerar un modelo dinámico de transmisión de rastreo del cólera y la genética de la población a través de ambientes acuáticos y huéspedes. Al igual que en modelos anteriores del cólera de nuestro grupo (27), nuestro modelo epidemiológico subyacente se basa en el marco susceptible-infectado-recuperado con reservorio (SIRW), una extensión del marco clásico susceptible-infectado-recuperado (SIR) con un compartimento añadido para la concentración de patógenos en un reservorio acuático (W) (Fig. 4 y Apéndice SI, Figs. S8 y S9). De acuerdo con Kirpich et al. (27), permitimos la replicación fuera del huésped, junto con la estacionalidad en la transmisión ambiental, la diseminación y la descomposición, como sugiere la correlación significativa en los recuentos de casos con la precipitación. Además de esta formulación epidemiológica, consideramos un componente evolutivo en nuestro modelo. Tanto la deriva neutra como las presiones de selección se tienen en cuenta en nuestro marco multilocus, en el que medimos Ne calculando la diversidad genética y utilizando enfoques coalescentes (Apéndice SI, Texto). En consonancia con otros estudios, asumimos un compromiso entre la supervivencia en el medio ambiente y la aptitud en la transmisión del huésped para los loci bajo selección. Los resultados de las simulaciones del modelo recapitulan las características cualitativas de los recuentos de casos Ne y mensuales (Fig. 4A y Apéndice SI, Fig. S8).
Modelo de transmisión mixta del cólera y predicción de la vacunación. (A) Ne (tamaño efectivo de la población) observado a partir de los datos (gris) y en la simulación con replicación ambiental (verde) y Ne en la simulación sin replicación ambiental (violeta). (B) Distintos escenarios de vacunación y control para la simulación del modelo con replicación ambiental, en particular coberturas de vacunación del 64% (tasa de 0,01 d-1), 88% (tasa de 0,04 d-1) y 64% con un aumento del 10% en la tasa de decaimiento ambiental. Aquí definimos la cobertura de vacunación como el porcentaje de reducción de individuos susceptibles (al alcanzar un estado estacionario aproximado después de 2 a 3 meses de vacunación). A diferencia de Kirpich et al. (27) y de las simulaciones sin replicación ambiental (Apéndice SI, Fig. S10) en las que una cobertura de vacunación del 64% erradica el patógeno en un año, aquí se necesita o bien más vacunación (cobertura del 88%) o bien un aumento de la descomposición ambiental (aumento del 10%) para controlar el cólera en presencia de replicación ambiental.
En primer lugar, tanto la salida del modelo como los datos muestran un aumento y una caída de Ne que reflejan inicialmente una rápida expansión seguida de una selección negativa tras el brote inicial (Fig. 4A). Luego vino la observación de un segundo crecimiento de Ne en 2013, mayor en extensión de lo que se esperaría sólo por la transmisión del huésped, producido por un brote estacional precedente y que se extiende a un período de reducción de la incidencia. Nuestra hipótesis de la diversificación dentro del reservorio acuático ofrece una explicación para este repunte relativo de Ne, y está apoyada por simulaciones de modelos razonables donde la inclusión de la replicación ambiental permite esta exploración evolutiva en contraste con los casos sin replicación ambiental (Fig. 4A y Apéndice SI, Fig. S8). En particular, durante el pico de finales de 2012 a mediados de 2013, se detectaron uuSNPs en los siguientes genes del linaje ambiental superviviente: Vch1786_I0012 (1 C→T), gen Vch1786_I0051 (3 C→T), Vch1786_I0998 (30 G→A), Vch1786_I1539 (44 A→G), rseA (52 G→A), epsG (61 A→C) y Vch1786_II0794 (107 C→A) (Apéndice SI, Fig. S3). Las mutaciones en estos genes pueden haber contribuido a una mayor adaptación de las cepas ambientales en el ecosistema acuático, aunque serán necesarios futuros estudios in vitro para investigar su contribución a la aptitud de V. cholerae. El pico en la replicación ambiental es seguido por una disminución sustancial en Ne que comienza antes del período de calma importante en 2014. De nuevo, la incidencia de casos no explica completamente la magnitud de este descenso. Aunque el cuello de botella de la población induce una disminución de Ne, las simulaciones sugieren que la replicación ambiental es necesaria para acelerar la fijación de los genes adaptados a la persistencia en el reservorio acuático. A finales de 2014, los reservorios ambientales se extienden a los hospedadores con un pico de casos clínicos, posiblemente potenciado por una adaptación beneficiosa del hospedador y/o la pérdida de inmunidad en la población de hospedadores. Las extensas simulaciones calibradas con los datos de los casos sugieren que, para ajustarse adicionalmente al Ne observado, debería incluirse en el modelo la replicación ambiental. Una importante ramificación de nuestros hallazgos es que la replicación y la adaptación dentro del reservorio acuático pueden dificultar las estrategias de control dirigidas a la transmisión del huésped. De hecho, proyectando hacia adelante desde 2015 en las simulaciones, observamos que la vacunación puede eliminar fácilmente el patógeno en ausencia de replicación ambiental (Apéndice SI, Fig. S10). Sin embargo, para que la adaptación ambiental y la replicación sean consistentes con el Ne observado, es necesario vacunar a una porción mucho mayor de la población o añadir una intervención que afecte al reservorio acuático para eliminar el cólera en nuestro modelo dinámico de transmisión mixta (Fig. 4B).