Deuteroitu kloroformi
13.4.4 Laitteen suorituskyvyn arviointi ja ylläpito
Laboratoriolaitteiden sisällyttäminen laboratoriosertifioinneissa käytettäviin laadunhallintajärjestelmiin (esim. ISO17025 analyyttisille laboratorioille) edellyttää laitteen suorituskyvyn arviointia ja ylläpitoa säännöllisin väliajoin. Nämä sertifioinnit antavat laboratorion analyytikkotutkijalle mahdollisuuden laatia toiminnan kvalifiointi (OQ) ja suorituskyvyn kvalifiointi (PQ) -testejä laitteen aiotun käyttötarkoituksen mukaisesti. Näin ollen NMR:n osalta OQ/PQ-testit voivat vaihdella laitteella suoritettavien yleisten analyyttisten testien mukaan. Nykyaikaisissa laitteissa on automaattisia menettelyjä, joissa käyttäjän on asetettava asianmukainen näyte, minkä jälkeen testisarja suoritetaan automaattisesti. Näiden testien päätteeksi annetaan raportti, jonka avulla käyttäjä voi arvioida spektrometrin kokonaissuorituskykyä.
Vesiliuoksissa olevien proteiiniterapeuttisten aineiden testaamiseksi näihin OQ-testeihin olisi sisällyttävä: lämpötilakalibrointi, deuteroidun kloroformin asetonisignaalin viivanmuodostus, deuteroidun kloroformin etyylibentseenisignaalien herkkyys ja/tai veden suppressio, johon liittyy herkkyysarviointi 2 mM:n sakkaroosiliuoksessa esiintyville anomeerisille protoneille. Lämpötilakalibrointi on tärkeää, koska ympäristön liuosolosuhteet vaikuttavat proteiinin dynamiikkaan, millä voi olla suuria vaikutuksia havaittuihin signaalien viivanleveyksiin ja taajuuksiin. Näytteen lämpötilan säätö NMR-spektrometreissä perustuu koettimen ilman lämpötilan ja virtausnopeuden huolelliseen hallintaan. Koetinilman vaikutus näytteen lämpötilaan voidaan mitata mittaamalla 100-prosenttisen metanoli- tai 100-prosenttisen etyleeniglykoliliuoksen kemiallisia siirtymiä. Nämä siirtymät on mitattu huolellisesti, jotta näytteen todellista lämpötilaa voidaan arvioida tietyllä koetinilman lämpötilan ja virtausnopeuden asetuksella.
Hyvän näytteen shimmauksen (eli yhtenäisen magneettikentän näytteen havaittavan osan poikki) vaikutusta spektrin laatuun ei voi liikaa korostaa: mitä kapeammat piikit, sitä parempi on mitattavien signaalien resoluutio ja herkkyys. Jos käytetään signaalinvaimennustekniikoita, mitä kapeampi on vaimennettavan piikin pohja, sitä paremmin esikyllästys tai kapeakaistaiset valikoivat signaalinvaimennustekniikat toimivat. Onneksi kenttäkartoitustekniikoiden ja gradienttisäätöjen käyttöönotto on yksinkertaistanut tätä usein aikaa vievää tehtävää, joka liittyy säätöasetusten säätämiseen kutakin näytettä varten. On kuitenkin näytteitä, joiden kohdalla shim-kartat eivät toimi hyvin, ja shim-säätöön on käytettävä aikaa optimaalisen laitteen vasteen saamiseksi.
Spektrometrin herkkyyden arviointi vakionäytteillä on ihanteellinen tapa seurata järjestelmän suorituskykyä, ja vakiotesteistä saatujen arvojen on täytettävä tai ylitettävä valmistajan asettamat spektrometrin tekniset vaatimukset. Huomattakoon, että valmistaja asettaa spektrometrin spesifikaatiot usein konservatiivisella tavalla varmistaakseen, että laite läpäisee nämä testit asennuksen yhteydessä. OQ/PQ-testien suorittaminen säännöllisin väliajoin antaa kuitenkin spektrometrin omistajalle mahdollisuuden tutustua kyseisen laitteen ominaisuuksiin. Poikkeamat rutiinitesteissä määritetyistä arvoista olisi tutkittava huolellisesti, koska ne voivat olla merkki laitteen toimintahäiriöstä.
Pienten molekyylien analysoinnissa orgaanisissa liuottimissa asetonisignaalin käyttäminen deuteroidussa kloroformissa, jotta saavutetaan lorentziläisen linjanmuodon ja kapean FWHH:n lisäksi myös kapea perusta (esim. <20 Hz 20 %:lla 13C-satelliittisignaalista), johtaa tavallisesti parhaimpaan herkkyytehokkuuteen deuteroidussa kloroformissa oleville etyylibentseenisignaaleille. Spektrien saamiseen vesiliuoksissa käytettävien spektrometrien osalta toinen herkkyysmittaus on tärkeämpi: spektrometrin kyky saada hyvä herkkyys ja resoluutio vesipiikin lähellä olevista signaaleista. Näin ollen herkkyyden mittaaminen anomeerisilla protonisignaaleilla standardista, joka koostuu 2 mM sakkaroosista 95-prosenttisessa H2O/5-prosenttisessa D2O-liuoksessa ja johon on sovellettu vesisuppressiota, on realistisempi mittari spektrometrin signaali-kohina-suorituskyvylle proteiiniterapeuttisten näytteiden NMR:ssä.
Proteiiniterapeuttisten lääkeaineiden laatua arvioivan spektrometrin PQ:n kannalta näiden lääkeaineiden kriittisenä laatuominaisuutena on spesifinen tertiäärirakenne, jonka aminohappoketjua taittamalla saadaan aikaan. Siksi 2D-rakennekartta-analyysia suorittavan spektrometrin PQ:na voidaan ajaa lyhyessä ajassa 2D-HSQC-spektrejä 15N- tai 13C-isotooppisesti rikastetulle näytteelle, jotta voidaan todeta spektrometrin kyky suorittaa pulssiohjelmia, joissa on tehokkaat irtikytkentäjärjestelyt ja gradienttikoherenssin valinta. Suljetuissa putkissa olevia 13C- tai 15N-isotooppirikastettuja proteiinistandardiliuoksia (esim. SH3-domeeniproteiini tai ubikitiini) on kaupallisesti saatavilla pitoisuuksina, joiden avulla tiedot voidaan kerätä muutamassa tunnissa. Sopivasti kalibroidut spektrometrit, joiden taajuus on vähintään 500 MHz ja jotka on varustettu kryosondilla, voivat mitata 2D-rakennekarttoja luonnollisen runsauden (eli ei-isotooppirikastettujen) proteiineista ∼1,0 mM:n pitoisuuksilla 2-3 päivän spektrometriajassa.