Illumina-värisekvensointi
GenomikirjastoEdit
Kun DNA on puhdistettu, on luotava DNA-kirjasto, genomikirjasto. Genominen kirjasto voidaan luoda kahdella tavalla, sonifikaatiolla ja tagmentoinnilla. Tagmentoinnissa transposaasit leikkaavat DNA:n satunnaisesti 50-500 bp:n kokoisiksi pätkiksi ja lisäävät samanaikaisesti adaptoreita. Geneettinen kirjasto voidaan luoda myös käyttämällä sonifikaatiota genomisen DNA:n pirstomiseen. Sonifiointi pirstoo DNA:n samankokoisiksi käyttäen ultraääniaaltoja. Oikea ja vasen adapteri on liitettävä T7-DNA-polymeraasilla ja T4-DNA-ligaasilla sonifioinnin jälkeen. Säikeet, joihin ei ole ligitoitu adaptereita, pestään pois.
AdaptersEdit
Adapterit sisältävät kolme erilaista segmenttiä: kiinteän tuen komplementtisekvenssin (oligonukleotidit virtaussolussa), viivakoodisekvenssin (indeksit) ja sekvensoinnin alukkeen sitoutumiskohdan. Indeksit ovat yleensä kuusi emäsparia pitkiä, ja niitä käytetään DNA-sekvenssianalyysin aikana näytteiden tunnistamiseen. Indeksit mahdollistavat jopa 96 eri näytteen ajamisen yhdessä, mikä tunnetaan myös nimellä multipleksointi. Analyysin aikana tietokone ryhmittelee kaikki lukemat, joilla on sama indeksi, yhteen. Illumina käyttää ”sequence by synthesis” -lähestymistapaa. Tämä prosessi tapahtuu akryyliamidilla päällystetyn lasisen virtaussolun sisällä. Virtaussolun pohjalla on oligonukleotideja (lyhyitä nukleotidisekvenssejä), jotka toimivat kiinteänä alustana, joka pitää DNA-säikeet paikoillaan sekvensoinnin aikana. Kun pirstoutunutta DNA:ta pestään virtaussolun yli, sopiva sovitin kiinnittyy komplementaariseen kiinteään tukeen.
SiltamerkkimonistaminenMuokkaa
Kiinnitettynä klustereiden muodostaminen voi alkaa. Tavoitteena on luoda satoja identtisiä DNA-säikeitä. Osa tulee olemaan etusuuntaista säiettä; loput käänteistä. Tämän vuoksi käytetään oikeaa ja vasenta sovitinta. Klusterit luodaan siltaamalla monistamalla. DNA-polymeraasi liikkuu DNA-juostetta pitkin luoden sen komplementaarisen juosteen. Alkuperäinen säie pestään pois, jolloin jäljelle jää vain käänteinen säie. Käänteisjuosteen yläosassa on adapterisekvenssi. DNA-juoste taipuu ja kiinnittyy oligoon, joka on komplementaarinen ylimmän adapterisekvenssin kanssa. Polymeraasit kiinnittyvät käänteisjuosteeseen, ja sen komplementaarinen juoste (joka on identtinen alkuperäisen kanssa) syntyy. Nyt kaksijuosteinen DNA denaturoidaan, jotta kumpikin juoste voi erikseen kiinnittyä virtaussoluun ankkuroituun oligonukleotidisekvenssiin. Toinen on käänteisjuoste ja toinen eteenpäin suuntautuva juoste. Tätä prosessia kutsutaan siltaamismonistamiseksi, ja se tapahtuu tuhansille klustereille koko virtaussolun alueella kerralla.
Klonaalinen monistaminenEdit
Kerta toisensa jälkeen DNA-juosteet taipuvat ja kiinnittyvät kiinteään alustaan. DNA-polymeraasi syntetisoi uuden säikeen luodakseen kaksoissäikeisen segmentin, ja se denaturoidaan niin, että kaikki DNA-säikeet yhdellä alueella ovat peräisin yhdestä lähteestä (klonaalinen monistuminen). Klonaalinen monistuminen on tärkeää laadunvalvonnan kannalta. Jos jossakin säikeessä havaitaan outo sekvenssi, tutkijat voivat tarkistaa käänteisen säikeen varmistaakseen, että siinä on saman outouden komplementti. Eteenpäin ja taaksepäin suuntautuvat säikeet toimivat tarkistuksina, joilla estetään artefaktojen syntyminen. Koska Illumina-sekvensoinnissa käytetään DNA-polymeraasia, on havaittu emästen vaihtumisvirheitä erityisesti 3′ päässä. Parilukemat yhdistettynä klusterin muodostamiseen voivat vahvistaa, että virhe on tapahtunut. Käänteisen ja etummaisen säikeen on oltava toisiaan täydentäviä, kaikkien käänteislukujen on vastattava toisiaan ja kaikkien etummaisten lukujen on vastattava toisiaan. Jos lukema ei ole riittävän samanlainen kuin sen vastakappaleet (joiden kanssa sen pitäisi olla klooni), on voinut tapahtua virhe. Joidenkin laboratorioiden analyyseissä on käytetty 97 %:n samankaltaisuuden vähimmäiskynnystä.
Sekvenssi synteesin mukaan Muokkaa
Kloonimonistuksen lopussa kaikki käänteislukusäikeet pestään pois virtaussolusta, jolloin jäljelle jäävät vain etusuuntaiset säikeet. Aloitin kiinnittyy eteenpäin suuntautuvien säikeiden adapterin alukkeen sitoutumiskohtaan, ja polymeraasi lisää fluoresoivasti merkityn dNTP:n DNA-juosteeseen. Kierrosta kohti voidaan lisätä vain yksi emäs, koska fluorofori toimii estoryhmänä; estoryhmä on kuitenkin palautuva. Nelivärikemian avulla jokaisella neljällä emäksellä on yksilöllinen emissio, ja jokaisen kierroksen jälkeen laite tallentaa, mikä emäs lisättiin. Kun väri on kirjattu, fluorofori pestään pois ja toinen dNTP pestään virtauskennon yli ja prosessi toistetaan. dATP:t, dTTP:t, dGTP:t ja dCTP:t pestään kennon yli erikseen, jotta jokainen nukleotidi voidaan tunnistaa.
Alkaen NextSeqin ja myöhemmin MiniSeqin lanseerauksesta Illumina otti käyttöön uuden kaksivärisen sekvensointikemian. Nukleotidit erotetaan toisistaan joko jommallakummalla värillä (punainen tai vihreä), ei millään värillä (”musta”) tai molempien värien yhdistelmällä (näkyvät oranssina punaisen ja vihreän sekoituksena).
Kun DNA-juoste on luettu, juuri lisätty juoste pestään pois. Sitten indeksi 1 -aloitin kiinnittyy, polymerisoi indeksi 1 -jaksoa ja pestään pois. Säie muodostaa jälleen sillan, ja DNA-säikeen 3′ pää kiinnittyy virtaussolun oligoon. Indeksi 2 -aloitin kiinnittyy, polymerisoi sekvenssin ja pestään pois.
Polymeraasi sekvensoi komplementaarisen säikeen kaarevan säikeen päälle. Ne erkanevat toisistaan, ja kummankin säikeen 3′-pää estyy. Eteenpäin suuntautuva säie pestään pois, ja sekvensointiprosessi toistuu käänteisen säikeen kohdalla.
Data-analyysi Muokkaa
Sekvensointi tapahtuu miljoonille klustereille kerralla, ja jokaisessa klusterissa on ~1000 identtistä kopiota DNA-insertistä. Sekvenssidata analysoidaan etsimällä fragmentteja, joissa on päällekkäisiä alueita, joita kutsutaan contigeiksi, ja asettamalla ne riviin. Jos referenssisekvenssi on tiedossa, contigeja verrataan siihen varianttien tunnistamiseksi.
Tämän pätkittäisen prosessin ansiosta tutkijat näkevät täydellisen sekvenssin, vaikka fragmentoimatonta sekvenssiä ei koskaan ajettu; koska Illuminan lukupituudet eivät kuitenkaan ole kovin pitkiä (HiSeq-sekvensoinnilla saadaan aikaan noin 90 bp:n pituisia lukupituuksia), lyhyiden tandemtoistumisalueiden selvittäminen voi olla vaikeaa. Lisäksi jos sekvenssi on de novo eikä referenssiä ole olemassa, toistuvat alueet voivat aiheuttaa paljon vaikeuksia sekvenssin kokoamisessa. Muita vaikeuksia ovat epätarkkojen polymeraasien aiheuttamat emäskorvaukset (erityisesti lukujen 3′-päässä), kimeeriset sekvenssit ja PCR-bias, jotka kaikki voivat vaikuttaa virheellisen sekvenssin tuottamiseen.