Toxigenic Vibrio cholerae evolution and establishment of reservoirs in aquatic ecosystems
Tulokset
Neljä departementtia – Artibonite, Centre, Nord-Ouest ja Ouest – vastaa 90 prosentista Haitin ilmoitetuista koleratapauksista (9). Keskityimme Ouestin departementtiin (kuva 1A), joka on runsaasti vesiekosysteemejä sisältävä rannikkoalue, jossa olemme eristäneet toksigeenistä V. cholerae O1 -bakteeria kiinteistä joki- ja suistoalueista (kuva 1A). Toksigeenisen V. cholerae O1:n esiintyminen vesieliöissä korreloi lämpötilan ja sademäärän nousun kanssa, mutta ei ulosteperäisten koliformisten bakteerien määrän kanssa, mikä viittaa siihen, että esiintyminen ei johtunut pelkästään ulosteperäisestä saastumisesta (10). Kuukausittaiset tapausmäärät Ouestissa, jotka vaihtelivat vuosittain mutta vähenivät kuivana kautena ja kasvoivat sadekaudella (huhtikuusta lokakuuhun), korreloivat lämpötilan ja sademäärän nousun kanssa (kuva 1B). Tämä on sopusoinnussa Bangladeshissa ja Perussa esiintyvän endeemisen V. cholerae O1 -bakteerin esiintymismallien kanssa, joissa kausittaiset koleraepidemiat korreloivat V. cholerae O1 -bakteerin lisääntyneen esiintymisen kanssa ympäristössä ja veden lämpötilan tai sademäärän nousun kanssa (11, 12) (11, 12).
Erottelemaksemme toisistaan valikoivan paineen (sopeutumisen) tai geneettisen ajelehtimisen aiheuttaman evoluution, laskimme nonsynonyymisen (dN) ja synonyymisen (dS) substituutionopeuden suhdeluvun (dN/dS) (SI-liite, kuva S6 ja taulukko S5). Kliinisten isolaattien evoluution dynamiikkaa ohjasi pääasiassa puhdistava valinta (dN/dS = 0,6, P < 0,001), mikä vastaa negatiivista Tajiman D:tä (-2,3, P < 0,005) ja populaatiota, jossa esiintyy pullonkauloja ja/tai valikoivia pyyhkäisyjä. Negatiivisen valinnan odotetaan ajavan ihmisillä jo vakiintunutta epidemiaa, joka on saavuttanut sopeutumismaiseman huipun monipuolistuvan valinnan ohjaaman varhaisen epidemiavaiheen aikana (14). Sitä vastoin ympäristön isolaateissa esiintyi suurempia nonsynonyymisiä määriä (dN/dS = 2,1, P < 0,001), mikä on ominaista heterogeeniselle mikrobipopulaatiolle, joka on hiljattain tuotu uuteen ympäristöön ja jossa on meneillään uusien varianttien aiheuttaman monipuolistavan valinnan fiksaatio. Itse asiassa löysimme ympäristökohtaisia molekyylijälkiä sellaisten V. cholerae -bakteerien genomeista, jotka menestyksekkäästi monistuivat ja säilyivät vesiympäristössä. Vuosien 2012 ja 2015 välisenä aikana ympäristöisolaattien fylogenian selkärangassa esiintyi yhteensä seitsemän koodaavilla alueilla esiintyvää ei-synonyymistä mutaatiota, jotka mahdollisesti antoivat valikoivaa etua V. cholerae -ympäristöpopulaatiolle (kuva 3 ja SI-liite, taulukko S7). Kolme ympäristöspesifistä mutaatiota, kaksi selkärangan haarautumisen alkuvaiheessa (kuva 3) ja yksi sisäisessä haarassa (SI-liite, taulukko S7), vaikuttivat tyypin II eritysjärjestelmän (TSSII) geeneihin: yleiseen eritysreittiin kuuluviin proteiineihin A ja G sekä K (SI-liite, taulukko S7). TSSII:llä on keskeinen rooli V. cholerae -bakteerin virulenssissa ja selviytymisessä eri kapeikoissa, kuten vesialtaissa tai ihmisisännissä (26). Muut sisäisistä haaroista löytyneet mutaatiot vaikuttivat geeneihin, jotka liittyvät ympäristöstressivasteeseen, V. choleraen kemotaksisuuteen/motiliteettiin vasteena vaihteleviin ympäristövihjeisiin, flagellumin koukun pituuden säätelyyn, biofilmin muodostumiseen suoliston ulkopuolisessa ympäristössä ja eksponentiaaliseen kasvuun vasteena saatavilla oleviin ravinteisiin (SI-liite, kuva S7 ja taulukko S7). Ympäristöisolaatteja, jotka vaikuttivat menestyksekkäästi kehittyvään ympäristölinjaan, kerättiin paitsi Gressierissä sijaitsevien sairaaloiden ja koleran hoitokeskusten läheisyydestä myös läheisiltä Goaven ja Carrefourin alueilta (kuva 3).
V. choleraen evoluutio ja sopeutuminen Haitin vesialtaissa. Haitista vuosina 2012-2015 kerättyjen 27 ympäristöisolaatin fylogeneettinen suhde ja maantieteellinen jakautuminen. Ympäristöpopulaation evoluution aikana saadut ei-synonyymiset mutaatiot, jotka on rekonstruoitu Bayesin päätelmällä esi-isien tiloista, on merkitty puun selkärangan varrelle. Puun rungon (eloonjääneen linjan) varrella havaitut SNP:t numeroitiin juoksevasti 1-7, jotta niitä olisi helpompi verrata SI-liitteen taulukossa S7 ilmoitettuihin lisätietoihin. Kartoissa näytteenottopaikat on ryhmitelty vesilähteen mukaan, ja ne on merkitty keltaisilla, punaisilla, oransseilla ja syaaninvärisillä pisteillä Gressierin alueella, violeteilla Carrefourin alueella ja sinisillä Jacmelin alueella.
Todisteet epidemiologisista ja ympäristöön liittyvistä evoluutiovoimista, jotka ohjaavat Haitin epidemian etenemistä, saivat meidät harkitsemaan dynaamista mallia, jossa koleran leviämistä ja populaatiogenetiikkaa seurataan vesiympäristöissä ja vesialueita ja -isäntiä käyttäen. Kuten ryhmämme aiemmissa koleramalleissa (27), epidemiologinen mallimme perustuu susceptible-infected-recovered with reservoir (SIRW) -malliin, joka on klassisen susceptible-infected-recovered (SIR) -mallin laajennus, johon on lisätty patogeenikonsentraatio vesialtaassa (W) (kuva 4 ja SI-liite, kuvat S8 ja S9). Kirpichin ja muiden (27) mukaisesti otimme huomioon isännän ulkopuolella tapahtuvan lisääntymisen sekä ympäristöstä tapahtuvan leviämisen, irtoamisen ja hajoamisen kausivaihtelun, kuten tapausten lukumäärän ja sademäärän merkittävä korrelaatio osoittaa. Tämän epidemiologisen muotoilun lisäksi otimme mallissamme huomioon evoluutiokomponentin. Sekä neutraali ajelehtiminen että valintapaineet otetaan huomioon monikantakuviokehyksessämme, jossa mittaamme Ne:tä laskemalla geneettisen monimuotoisuuden ja käyttämällä koalesenssimenetelmiä (SI-liite, teksti). Muiden tutkimusten mukaisesti oletimme, että ympäristössä selviytymiskyvyn ja isännän siirtokyvyn välillä vallitsee kompromissi valinnan kohteena olevien lokusten osalta. Mallisimulaatioiden tulokset toistavat Ne:n ja kuukausittaisten tapausmäärien laadulliset piirteet (Kuva 4A ja SI-liite, Kuva S8).
Koleran sekamuotoinen leviämismalli ja rokotusennuste. (A) Ne (efektiivinen populaatiokoko) havaittu datan perusteella (harmaa) ja simulaatiossa, jossa on ympäristön replikaatio (vihreä) ja Ne simulaatiossa ilman ympäristön replikaatiota (violetti). (B) Erilaiset rokotus- ja torjuntaskenaariot ympäristökertaistumisen sisältävässä mallisimulaatiossa, erityisesti rokotuspeittävyydet 64 % (nopeus 0,01 d-1), 88 % (nopeus 0,04 d-1) ja 64 % ympäristön hajoamisnopeuden kasvaessa 10 %. Rokotuskattavuus määritellään tässä rokotuksille alttiiden yksilöiden prosentuaalisena vähenemisenä (kun saavutetaan likimääräinen vakaa tila 2-3 kuukauden rokottamisen jälkeen). Toisin kuin Kirpich et al. (27) ja simulaatiot, joissa ei esiinny ympäristön replikaatiota (SI-liite, kuva S10) ja joissa 64 prosentin rokotuskattavuus hävittää taudinaiheuttajan vuoden kuluessa, tässä tapauksessa tarvitaan joko enemmän rokotuksia (88 prosentin rokotuskattavuus) tai lisääntynyttä ympäristön rappeutumista (10 prosentin kasvu) koleran hallitsemiseksi ympäristön replikaation yhteydessä.
Ensiksikin sekä mallin tulosteessa että datassa näkyy aluksi Ne:n nousu ja lasku, mikä heijastaa nopeaa leviämistä, jota seuraa negatiivinen valikoituminen ensimmäisen taudinpurkauksen jälkeen (kuva 4A). Sitten havaittiin Ne:n toinen kasvu vuonna 2013, joka oli laajempi kuin pelkän isännän siirtymisen perusteella olisi odotettavissa, ja joka johtui edeltävästä kausiluonteisesta puhkeamisesta ja jatkui kauteen, jolloin esiintyvyys väheni. Hypoteesimme monipuolistumisesta vesivarastossa tarjoaa selityksen tälle Ne:n suhteelliselle nousulle, ja sitä tukevat kohtuulliset mallisimulaatiot, joissa ympäristön replikaation sisällyttäminen mahdollistaa tämän evoluutiotutkimuksen toisin kuin tapauksissa, joissa ympäristön replikaatiota ei ole (kuva 4A ja SI-liitteen kuva S8). Erityisesti vuoden 2012 lopun ja vuoden 2013 puolivälin välisen huipun aikana uuSNP:tä havaittiin seuraavissa eloonjääneen ympäristölinjan geeneissä: Vch1786_I0012 (1 C→T), Vch1786_I0051-geeni (3 C→T), Vch1786_I0998 (30 G→A), Vch1786_I1539 (44 A→G), rseA (52 G→A), epsG (61 A→C) ja Vch1786_II0794 (107 C→A) (SI-liite, kuva S3). Mutaatiot näissä geeneissä ovat saattaneet edistää ympäristökantojen lisääntynyttä sopeutumista vesiekosysteemissä, vaikkakin tarvitaan tulevia in vitro -tutkimuksia, jotta voidaan tutkia niiden osuutta V. cholerae -kuntoon. Ympäristössä tapahtuvan lisääntymisen huippua seuraa huomattava lasku Ne:ssä, joka alkaa ennen vuoden 2014 suurta taukojaksoa. Tapausten esiintyvyys ei tässäkään tapauksessa selitä täysin tämän laskun suuruutta. Vaikka populaation pullonkaula aiheuttaa Ne:n vähenemisen, simulaatiot viittaavat siihen, että ympäristössä tapahtuva monistuminen on välttämätöntä, jotta voidaan nopeuttaa sellaisten geenien kiinnittymistä, jotka ovat sopeutuneet pysymään vesivarastossa. Vuoden 2014 lopulla ympäristösäiliöt leviävät isäntäpopulaatioihin, jolloin kliiniset tapaukset lisääntyvät, mikä saattaa johtua isännän suotuisasta sopeutumisesta ja/tai isäntäpopulaation immuniteetin heikkenemisestä. Laajat simulaatiot, jotka on kalibroitu tapaustietojen mukaan, viittaavat siihen, että ympäristössä tapahtuva replikaatio olisi sisällytettävä malliin, jotta se sopisi havaittuun Ne:hen. Havaintojemme merkittävä seuraus on, että replikaatio ja sopeutuminen vesivarastossa voi vaikeuttaa isännän tartuntaan tähtääviä torjuntastrategioita. Simuloinneissa vuodesta 2015 eteenpäin havaitsimme, että rokottaminen voi helposti poistaa taudinaiheuttajan ilman ympäristön replikaatiota (SI-liite, kuva S10). Jos ympäristöön sopeutuminen ja replikaatio ovat kuitenkin havaitun Ne:n mukaisia, paljon suuremman väestönosan rokottaminen tai vesivarastoon vaikuttavan toimenpiteen lisääminen on tarpeen koleran hävittämiseksi dynaamisessa sekasiirtomallissamme (Kuva 4B).