Les neutrophiles transmigrés dans la lumière intestinale engagent ICAM-.1 pour réguler la barrière épithéliale et le recrutement des neutrophiles

Les neutrophiles transmigrés dans la lumière intestinale engagent ICAM-.1 pour réguler la barrière épithéliale et le recrutement des neutrophiles

ICAM-1 favorise l’adhésion et la locomotion des PMN sur la membrane épithéliale apicale dans les conditions de l’inflammation

Dans les abcès de la crypte, comme observé dans les MICI actives, les PMN infiltrant les cryptes intestinales sont souvent observés en contact intime avec la surface épithéliale apicale (luminale).14 Pour examiner les interactions PMN-IEC au cours des étapes tardives du TEM, nous avons modélisé la migration des PMN à travers l’épithélium intestinal dans des conditions inflammatoires en utilisant une configuration transwell décrite précédemment.19 Le TEM des PMN dans la direction physiologique basolatérale-apicale à travers des IEC T84 témoins ou traités à l’interféron-γ (IFNγ) a été induit par l’ajout d’un gradient transépithélial de N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLF) (100 nM). L’exposition des IEC T84 à l’IFNγ (100 U ml-1, 24 h) n’a eu aucun effet significatif sur la fonction de barrière des IEC ou sur l’expression et la localisation subcellulaire des protéines de jonction clés JAM-A, Occludin et ZO-1 (figure supplémentaire S1 en ligne). Le traitement par IFNγ n’a pas eu d’effet significatif sur le nombre de PMN qui ont terminé la TEM ; cependant, il a augmenté de manière significative le nombre de PMN associés apicalement (de 8,7±1,8 %, non traité, à 19,7±1,9 %, IFNγ, apical, Figure 1a). En accord avec cette augmentation, le nombre de PMN non migrés (PMN dans la chambre supérieure, basal) a été significativement réduit (∼1,5 fois) après traitement par IFNγ, suggérant une augmentation du taux de migration (Figure 1a). Le nombre de PMN au sein de la monocouche épithéliale (épith) n’a pas été modifié. Des images confocales d’immunofluorescence représentatives (Figure 1b, panneaux supérieurs) et des projections en z (panneaux inférieurs) montrent les PMN associés apicalement après la migration à travers les monocouches T84 stimulées par l’IFNγ, mais pas les monocouches de contrôle. Comme il a été démontré précédemment que l’IFNγ induit l’expression d’ICAM-1 dans l’épithélium enflammé,27 nous avons émis l’hypothèse que pendant l’inflammation, les PMN migrant à travers les monocouches épithéliales restaient adhérentes à la membrane apicale par le biais d’interactions dépendantes de Mac-1 et d’ICAM-1, et seraient donc capables de locomotion dépendante d’ICAM-1 comme cela a été précédemment observé dans l’endothélium vasculaire24, 28 Confirmant les résultats précédents, le traitement par l’IFNγ (100 U ml-1, 24 h) a induit une augmentation robuste et dépendante du temps de l’expression d’ICAM-1 (avec un pic 24 h après le traitement, Figure 1c,d) sur la membrane apicale des IEC T84 (Figure 1e). Cet effet était spécifique à l’IFNγ, car l’exposition des IEC T84 et SKCO15 au facteur de nécrose tumorale-α (TNFα ; 10 ng ml-1) n’a pas induit l’expression d’ICAM-1 (figure supplémentaire S2A,B). La régulation à la hausse de l’ICAM-1 a également été observée dans l’épithélium de la crypte de biopsies coliques de patients atteints de colite ulcéreuse active par rapport à la muqueuse saine (Figure 1f). De plus, confirmant l’adhésion PMN dépendante d’ICAM-1 et de Mac-1 aux membranes apicales de l’IEC, l’ajout d’anticorps bloquant la fonction anti-ICAM-1 ou anti-Mac-1 (Abs ; 20 μg ml-1) a inversé l’augmentation de l’adhésion PMN induite par l’IFNγ (figure supplémentaire S3A). De manière intéressante, l’inhibition de Mac-1 des PMN a entraîné une réduction plus puissante (>3 fois) de l’adhésion des PMN par rapport à l’inhibition de ICAM-1, ce qui suggère que Mac-1 se lie à d’autres ligands de surface épithéliale en plus de ICAM-1.

Nous avons ensuite examiné si les PMN adhérant de manière apicale après avoir traversé l’épithélium présentaient une locomotion apicale. La microscopie time-lapse à contraste de phase a été utilisée pour suivre et quantifier le comportement des PMN individuelles attachées à la membrane apicale de l’IEC. En l’absence de stimulus exogène, les PMN ont peu bougé ; cependant, 59,3±7,6 % des PMN associés à la membrane apicale après leur migration à travers les IEC ont présenté un comportement hautement mobile (Figure 2a) avec des distances de reptation moyennes de 65,6±6,2 μm (Figure 2b). La TEM a induit une augmentation robuste de l’expression de Mac-1 sur la surface cellulaire des PMN (Figure 2c), ce qui est cohérent avec son rôle dans les interactions apicales PMN-IEC. Il est important de noter que le nombre de PMN présentant une locomotion apicale était significativement augmenté lorsque les IEC étaient stimulées par l’IFNγ pour réguler positivement l’ICAM-1 (88±3,6%, IFNγ, vs. 59,3±7,6%, IEC non traitées). Dans ces conditions, les PMN ont parcouru des distances significativement plus longues (101±10,0 μm, IFNγ, vs. 65,6±6,2 μm, IEC non traitées, Figure 2b) le long de la membrane épithéliale apicale. Confirmant le rôle de l’ICAM-1 dans la médiation de la locomotion des PMN, l’ajout d’un anticorps anti-ICAM-1 (Ab) bloquant la fonction a inversé les effets de l’IFNγ, réduisant à la fois le nombre et les distances parcourues par les PMN (61,4±7,8 % et 73,6±6,1 μm, respectivement, Figure 2a,b). L’inhibition de Mac-1 a aboli la locomotion des PMN adhérentes restantes (figure 2a et films supplémentaires S1 et S2), confirmant un rôle exclusif de Mac-1 dans ce processus. Les effets de l’inhibition de Mac-1 sur la locomotion des PMN sont mis en évidence par des séquences d’images time-lapse (Figure 2d) et par les trajectoires de déplacement de six PMN représentatifs (Figure 2e). Les vitesses de reptation des PMN variaient de 3 à 7 μm min-1 et n’étaient pas significativement différentes sur les IEC non stimulées vs stimulées par l’IFNγ (figure supplémentaire S3B).

L’adhésion des PMN à la membrane épithéliale apicale compromet la fonction de barrière épithéliale

Nous avons ensuite examiné les effets des interactions des PMN avec les ligands épithéliaux exprimés de manière apicale sur la fonction de barrière épithéliale. Dans ces expériences, les PMN ont été ajoutés de manière apicale à des IEC T84 confluents cultivés sur des supports perméables (taille des pores de 0,4 μm, trop petits pour permettre le TEM des PMN), et le TER, en tant qu’indice de la barrière épithéliale, a été mesuré sur 12-h dans des conditions spécifiques. La période de 12 heures a été choisie pour éviter les effets des PMN apoptotiques sur la barrière épithéliale.29 L’adhésion des PMN stimulées par le fMLF (100 nM) aux IEC T84 a déclenché une diminution de la TER en fonction du temps sur une période de 12 heures (∼60 %, figure 3a). Il est important de noter que l’ajout de PMN à la membrane apicale des IEC T84 prétraités par l’IFNγ, dont nous avons montré qu’il entraîne une augmentation de l’adhésion des PMN dépendante de l’ICAM-1 (figure 1a), a entraîné une nouvelle diminution de la RET (∼40 % pendant les 2 premières heures et ∼90 % pendant 12 heures). Le traitement par l’IFNγ seul n’a eu aucun effet sur la TER. Pour vérifier si l’augmentation observée de la perméabilité épithéliale était due à un contact direct entre les cellules épithéliales et les PMN, nous avons utilisé un Ab inhibiteur anti-Mac-1 (CBRM1/29, 20 μg ml-1) pour inhiber l’adhésion des PMN aux IEC stimulées par l’IFNγ. L’inhibition de Mac-1 a atténué de manière significative la diminution de la TER induite par les PMN après stimulation par l’IFNγ (figure 3a). Dans des expériences séparées, nous avons confirmé que la diminution de la TER induite par les PMN dans les monocouches épithéliales non stimulées et traitées par l’IFNγ dépendait du contact direct entre les PMN et la membrane épithéliale apicale et n’était pas médiée par des mécanismes paracrines. Dans ces expériences, les PMN ont été ajoutés à la chambre inférieure de transwells contenant des monocouches T84 inversées (face apicale tournée vers le bas) et stimulés avec du fMLF (100 nM). Dans ces conditions, il n’y avait aucun effet des PMN sur la barrière épithéliale évaluée par TER (figure 3b). L’exposition des monocouches épithéliales à 100 nM de fMLF pendant 12 h n’a eu aucun effet significatif sur le TER.

La ligature de l’ICAM-1 épithélial déclenche une augmentation de la perméabilité épithéliale intestinale dépendante de MLCK

Nous avons observé que l’upregulation apicale de l’ICAM-1 potentialisait significativement les effets de l’adhésion PMN dépendante de Mac-1 sur la barrière épithéliale (Figure 3a). Nous avons donc émis l’hypothèse que l’augmentation de la perméabilité induite par les PMN dans les monocouches épithéliales traitées par l’IFNγ était due au regroupement de l’ICAM-1 médié par le contact avec les PMN et à l’induction d’événements de signalisation dépendants de l’ICAM-1, comme décrit précédemment dans l’endothélium vasculaire.30, 31 Des monocouches d’IEC T84 sur des supports perméables ont été traitées par l’IFNγ pour induire l’expression de l’ICAM-1, suivie par l’ajout d’Abs de réticulation de l’ICAM-1. Nous avons confirmé que la réticulation médiée par Ab induisait le regroupement d’ICAM-1 (figure supplémentaire S2C). Comme le montre la figure 4a, la réticulation de l’ICAM-1 par Ab a entraîné une diminution de la TER en fonction du temps, qui était corrélée à une augmentation du flux paracellulaire de l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC)-dextran (3 kDa, figure 4b). Cet effet était spécifique de l’ICAM-1, car la réticulation d’autres molécules de la surface épithéliale, du complexe majeur d’histocompatibilité-1 (CMH-1 ; figure 4) et du ligand PMN connu, le CD55 (figure supplémentaire S5), n’a eu aucun effet significatif sur la perméabilité. Conformément à l’absence d’expression d’ICAM-1 sur les IEC T84 non stimulées, l’application d’Abs de réticulation sur la surface apicale de ces IEC en l’absence de stimulation par l’IFNγ n’a eu aucun effet sur la TER (figure supplémentaire S4A). De même, conformément à la localisation de l’ICAM-1 induite par l’IFNγ sur la membrane épithéliale apicale, l’application d’Abs de réticulation sur l’aspect basolatéral des monocouches épithéliales n’a eu aucun effet significatif sur la fonction de barrière (figure supplémentaire S4B).

Nous avons précédemment montré que les événements précoces du TEM des PMN (au niveau de la membrane épithéliale basolatérale) déclenchent des diminutions du TER médiées par MLCK9. Il a été démontré que MLCK joue un rôle clé dans la régulation de la perméabilité épithéliale en régulant la contraction de l’anneau d’actomyosine périjonctionnel par la phosphorylation de la chaîne légère régulatrice de la myosine II.32 Nous nous sommes donc demandé si l’augmentation de la perméabilité de la CEI après la ligature de l’ICAM-1 exprimé de manière apicale dépendait de MLCK. En effet, la réticulation de l’ICAM-1 par Ab a entraîné la phosphorylation de la MLCK (Tyr 464), ce qui est cohérent avec l’activation de la MLCK (Figure 4c). Cette activation s’est accompagnée d’une diminution de la bordure en brosse apicale et de la F-actine périjonctionnelle (Figure 4d), ce qui indique une réorganisation du cytosquelette d’actine. Fait important, l’inhibition de la phosphorylation de MLCK induite par la ligature de l’ICAM-1 dans les cellules T84 avec ML-7 (20 μM,33 figure supplémentaire S4C) a empêché la réorganisation de la F-actine induite par l’ICAM-1 (figure 4d), la diminution de la TER (figure 4a) et l’augmentation du flux de dextran paracellulaire (figure 4b). Le traitement par ML-7 (20 μM) seul n’a eu aucun effet sur la TER. Ensemble, ces données suggèrent que dans des conditions inflammatoires, le contact des PMN avec la surface apicale des cellules épithéliales de la crypte déclenche des événements de signalisation dépendants de l’ICAM-1, entraînant une perméabilité accrue.

L’engagement d’ICAM-1 sur la membrane épithéliale apicale facilite l’amélioration du TEM des PMN

Comme la ligature d’ICAM-1 exprimé de manière apicale augmentait la perméabilité épithéliale, nous avons réalisé des expériences pour examiner si les altérations dépendantes d’ICAM-1 dans la fonction de barrière épithéliale entraîneraient une amélioration du TEM des PMN. Nous avons d’abord cherché à savoir si l’engagement des PMN dans ICAM-1 sur la membrane apicale de la CEI affectait le TEM des PMN dans la direction basolatérale-apicale physiologiquement pertinente.34 Dans ces expériences, les PMN ont été stimulées pour migrer à travers des monocouches épithéliales et les cellules transmigrées ont été collectées et réappliquées pendant 1 h sur la surface apicale de nouvelles monocouches épithéliales (2,5 × 105 PMN par monocouche) avec ou sans prétraitement par IFNγ. Après 1 h de contact PMN-épithélium, les monocouches ont été lavées pour éliminer les PMN adhérentes et utilisées pour les essais TEM PMN suivants dans la direction basolatérale-apicale. L’introduction apicale de PMN dans des monocouches épithéliales traitées par IFNγ, mais pas dans des monocouches non traitées, a provoqué une augmentation significative du TEM des PMN (1,7 fois, Figure 5a). Le traitement IFNγ seul ou la présence de PMN près de la surface apicale, mais sans contact direct avec les monocouches, n’ont eu aucun effet sur le TEM des PMN (Figure 5a). Dans des expériences parallèles, le TEM des PMN a été examiné après une réticulation spécifique de l’ICAM-1 par Ab. Conformément à l’effet du réticulage de l’ICAM-1 sur la fonction barrière des IEC, le réticulage par Ab de l’ICAM-1 sur les IEC T84 traitées par IFNγ a augmenté de manière significative le TEM des PMN (1,9±fold, Figure 5b) par rapport au réticulage d’une molécule témoin exprimée de manière apicale, MHC-1. Comme prévu, l’application des protocoles de réticulation de l’ICAM-1 à des monocouches d’IEC non traitées n’a pas eu d’effet significatif sur le TEM des PMN. Ensemble, ces résultats suggèrent que les PMN adhérant à la membrane apicale (luminale) de l’IEC par engagement d’ICAM-1 peuvent déclencher des altérations de la fonction de barrière épithéliale et contribuer à la régulation du recrutement des PMN.

La réticulation de l’ICAM-1 a entraîné l’activation de MLCK, suggérant une contraction de l’actine-myosine (Figure 4). Ainsi, nous avons ensuite examiné les effets de l’inhibition de la MLCK et de l’inhibition des forces contractiles de la F-actine sur le TEM des PMN après réticulation de l’ICAM-1. L’augmentation du TEM des PMN induite par le réticulation de l’ICAM-1 a été inversée lorsque les IEC ont été prétraitées avec l’inhibiteur MLCK ML-7 (20 μM, 1 h33) ou l’inhibiteur du moteur II de la myosine, la Blebbistatine (10 μM, 1 h,35 Figure 5c). Ces résultats suggèrent un rôle de la contraction de l’actomyosine en aval de l’ICAM-1 dans la régulation du TEM des PMN. Le traitement avec ML-7 ou la blebbistatine seule n’a pas eu d’effet sur le TEM des PMN (Figure 5c).

La ligature d’ICAM-1 médiée par un AcM dans la lumière intestinale murine entraîne une augmentation de la perméabilité épithéliale dépendante de MLCK et un recrutement accru des PMN

Nous avons ensuite réalisé des expériences in vivo pour examiner l’effet de la ligature d’ICAM-1 sur la fonction de barrière épithéliale intestinale et le recrutement des PMN, en utilisant un modèle de boucle intestinale de souris (Figure 6b). Dans ce modèle, la perméabilité de segments intacts de l’intestin grêle, perfusés au sang, a été évaluée après l’introduction de FITC-dextran dans la lumière intestinale. Comme le montre la figure 6a, bien que l’ICAM-1 n’ait pas été détecté dans l’épithélium non stimulé (panneau supérieur), l’administration intrapéritonéale (i.p.) d’IFNγ et de TNFα (500 ng, 24 h) a entraîné une forte induction de l’expression de l’ICAM-1. En particulier, l’ICAM-1 induit s’est localisé dans les régions apicales des IEC de la crypte murine au-dessus de la Claudin-2 (Figure 6a, panneau inférieur). En parallèle, nous avons observé que le traitement par les cytokines entraînait une augmentation d’un facteur ∼2 de la perméabilité du FITC-dextran de 3 kDa (figure 6c).

Important, l’introduction d’Abs de réticulation d’ICAM, mais pas d’Abs de la protéine témoin, MHC-1 dans la lumière des boucles intestinales stimulées par les cytokines a induit une augmentation supplémentaire ∼1,5 fois de la perméabilité au dextran par rapport au traitement par cytokine seule (Figure 6c). Pour confirmer que les augmentations de la perméabilité de l’épithélium intestinal étaient spécifiquement médiées par les événements de signalisation induits par l’ICAM-1 épithélial, nous avons utilisé des peptides dérivés du domaine cytoplasmique de l’ICAM-1 (peptide ICAM-1) pour inhiber la capacité de l’ICAM-1 à médier les événements de signalisation en aval. Il a été démontré précédemment dans l’endothélium vasculaire que l’ICAM-1, mais pas le peptide de contrôle, inhibait les interactions entre l’ICAM-1 et les protéines cibles, empêchant ainsi la signalisation dépendante de l’ICAM-1 sans affecter la liaison aux ligands leucocytaires extracellulaires.22, 24 L’ajout d’ICAM-1, mais pas du peptide de contrôle (100 μg ml-1, 30 min), a inhibé les augmentations de la perméabilité intestinale induites par la ligature de l’ICAM-1 (figure 6c). Il a été confirmé que les Abs introduites par voie intraluminale dans les boucles intestinales (non stimulées et après l’activation par l’IFNγ/TNFα) ne traversaient pas l’épithélium, ce qui exclut la contribution indirecte potentielle des cellules de la lamina propria aux effets observés (figure supplémentaire S6).

A l’appui du rôle de la MLCK dans la signalisation médiée par l’ICAM-1, l’inhibition de l’activation de la MLCK à l’aide de ML-7 (1 mg kg-1, i.p.36) avant la réticulation de l’ICAM-1 a empêché l’augmentation de la perméabilité (Figure 6c). Ces données démontrent que l’augmentation de la perméabilité épithéliale intestinale in vivo après la ligature de l’ICAM-1 est MLCK dépendante.

Comme l’augmentation de la perméabilité épithéliale est associée à une augmentation de la migration des PMN, nous nous sommes demandé si la ligature de l’ICAM-1 conduirait à une augmentation du recrutement des PMN in vivo. En utilisant le modèle de boucle intestinale murine, l’infiltration des PMN dans la muqueuse intestinale et la migration dans la lumière ont été induites par l’administration luminale du chimioattractant CXCL1 (1 μM dans 200 μl de solution saline équilibrée de Hank (HBSS)+) et quantifiées respectivement par marquage par immunofluorescence/microscopie focale et analyse du liquide de lavage préparé sur cytospines et coloré au Diff-Quik. En l’absence de chimioattractant, les PMN n’ont pas été détectés dans l’épithélium intestinal ou dans la lumière intestinale (non montré) ; cependant, l’administration luminale de CXCL1 a déclenché une migration significative des PMN dans la couche épithéliale (Figure 7a) et une accumulation dans la lumière intestinale (Figure 7c). Conformément à l’augmentation de la perméabilité induite par les cytokines, le traitement par IFNγ/TNFα a multiplié par ∼2,2 le nombre de PMN dans l’épithélium intestinal, et par ∼1,7 dans la lumière. Il est important de noter que l’ajout d’Abs de réticulation de l’ICAM-1 dans la lumière des boucles intestinales traitées aux cytokines a encore augmenté (par rapport au traitement aux cytokines seul) le nombre de PMN à la fois dans l’épithélium (∼1,6 fois, Figure 7a,b) et dans la lumière (∼1,4 fois, Figure 7c,d). Les PMN (en vert) infiltrant l’épithélium intestinal (en rouge) sont représentés sur des images représentatives de coupes de tissus provenant de boucles intestinales activées par des cytokines après ligature de l’ICAM-1 (Figure 7b). De même, les PMN qui ont migré dans la lumière après la ligature d’ICAM-1 sont montrés dans des images représentatives de liquides de lavage provenant de boucles intestinales (Figure 7d).

Concordant avec les augmentations de la perméabilité épithéliale induites par la ligature de l’ICAM-1, la migration accrue des PMN dans la lumière intestinale dépendait des événements de signalisation médiés par l’ICAM-1 et de l’activation de la MLCK. L’ajout intraluminal du peptide ICAM-1, mais pas du peptide témoin (non montré ; 100 μg ml-1, 30 min), et l’inhibition de la MLCK (ML-7, 1 mg kg-1, i.p.) avant la réticulation de l’ICAM-1 par Ab ont complètement inhibé l’augmentation de la migration des PMN induite par la ligature de l’ICAM-1 (Figure 7a,c). Ces résultats suggèrent que l’engagement de l’ICAM-1 sur la membrane épithéliale intestinale apicale dans des conditions d’inflammation compromet la fonction de barrière, facilitant ainsi le recrutement accru de PMN in vivo.