Production d’albumine humaine chez le porc par le biais de CRISPR/Cas9-.Knockin Mediated of Human cDNA into Swine Albumin Locus in the Zygotes
L’albumine sérique humaine (HSA) est la protéine plasmatique la plus abondante qui joue des fonctions homéostatiques critiques dans la physiologie humaine, notamment le maintien de la pression oncotique plasmatique, la régulation de la distribution des fluides corporels, le transport de petites molécules, etc1. Il est prescrit pour un certain nombre de maladies graves telles que l’insuffisance hépatique et le choc traumatique2. En raison de la pénurie de sang humain et des risques associés au sang humain, une production alternative d’albumine humaine est recherchée depuis longtemps. La production d’HSA recombinante a déjà été tentée chez le porc par l’expression dominante de transgènes sous la forme d’une fusion albumine-GFP3. Cependant, dans les approches transgéniques, en raison de la présence d’albumine porcine endogène, la séparation et la purification de la rHSA sont problématiques. En profitant de la puissance du système CRISPR/Cas9 pour la modification du génome, nous avons cherché à produire la rHSA chez le porc en introduisant l’ADNc de l’albumine humaine dans le locus de l’albumine porcine. En insérant l’ADNc de l’ALB humaine plus la séquence signal polyA du SV40 (2368 pb au total) dans le locus Alb du porc immédiatement en aval du codon de départ, nous nous attendons à ce que l’ALB humaine soit exprimée sous le contrôle transcriptionnel de l’albumine endogène du porc et bloque en même temps l’expression de l’albumine endogène du porc (Fig. 1a). Nous avons conçu un sgRNA ciblant la région du codon de départ (immédiatement 5′ de et incluant ATG) et avons généré un fragment de ciblage (donneur pour la recombinaison homologue) avec l’insert flanqué de séquences d’homologie de 1 kb des deux côtés (Fig. 1a). Comme la séquence d’homologie 5′ utilisée dans le donneur va jusqu’au codon de départ, elle contient la séquence sgRNA et peut donc être ciblée par le sgRNA en tant que donneur ou l’allèle knockin après recombinaison homologue. Pour éviter cela, nous avons inséré 6 pb (gccacc) dans la séquence sgRNA juste avant le codon de départ. Le sgRNA a été transcrit in vitro, purifié et injecté dans les ovocytes fécondés avec le mRNA4 de Cas9 et le vecteur circulaire contenant le fragment de ciblage. La source des ovocytes était le minipig Bama5. Les embryons injectés ont été cultivés pendant 1 à 2 heures avant d’être implantés dans des femelles synchronisées en œstrus. ~Environ 300 embryons ont été implantés chez 10 femelles, dont 5 sont devenues enceintes et ont donné naissance à un total de 16 chiots vivants. Les chiots ont reçu des soins standard et n’ont montré aucun signe de problèmes de santé inhabituels.
Knockin de l’ALB humaine dans le locus Alb porcin.
(a) Schéma de la stratégie de knockin. (b) Génotypage des fondateurs. Les amorces PRC sont illustrées en (a). (c) Résultats du séquençage des produits PCR obtenus avec la paire d’amorces e/f (a). Les produits ont été clonés et jusqu’à 12 clones (pour #9) ont été séquencés.
Nous avons coupé les extrémités des oreilles des 16 porcelets lorsqu’ils avaient environ 4 semaines et obtenu de l’ADN génomique pour le génotypage. Pour déterminer si nous avions réussi le knockin, nous avons évalué les deux extrémités 5′ et 3′ du site d’insertion. Nous avons utilisé deux paires d’amorces, a/b et c/d (Fig. 1a). L’amorce a est à l’extérieur de l’extrémité 5′ de l’homologie utilisée et b est sur l’ALB humaine (l’insert) ; c est sur l’ALB humaine et d à l’extérieur de l’extrémité 3′ de l’homologie. Comme le montre la figure 1b, les 16 porcelets portent l’allèle knockin prévu. Nous avons cloné et séquencé tous les fragments d’ADN amplifiés. Ils étaient les produits de recombinaison homologues attendus (Fig. S1). Ensuite, nous avons déterminé le statut de l’allèle de type sauvage chez ces porcelets. Les amorces e et f (contenues dans l’insert) (Fig. 1a) devraient amplifier un fragment de 705 pb du locus sauvage et un fragment de 3085 pb de l’allèle knockin. Comme prévu, tous ont généré le fragment de 3085 pb. Cependant, de façon inattendue, nous avons pu obtenir le fragment apparent de 705 pb du locus sauvage à partir de seulement 7 (# 5, 6, 9, 10, 12, 13 et 15) des 16 échantillons, les autres générant des produits faibles autour de 700 pb (Fig. 1b). L’absence apparente de l’allèle de type sauvage chez certains porcelets suggère que le knockin a pu se produire sur les deux allèles. Alternativement, l’allèle sauvage pourrait avoir été édité de telle manière que la séquence de l’amorce a a été supprimée, entraînant l’échec de l’amplification de l’allèle sauvage. En effet, l’édition de l’allèle sauvage a eu lieu car la taille des fragments amplifiés différait des 705 pb prédits chez certains porcelets (Fig. 1b). Pour confirmer cela, nous avons cloné et séquencé tous les fragments amplifiés. Comme le montre la figure 1c, ils étaient tous édités, bien que certains n’aient été modifiés que de quelques paires de bases (ils semblaient donc être à 705 pb). Parmi ces allèles modifiés, ceux trouvés chez le porcelet #10 et #12 sont intéressants. Celui du porcelet #10 était le produit du remplacement d’un tronçon de 29 pb (de l’ATG vers l’extrémité 3′) de la séquence du porc par 36 pb (6 pb 5′ de l’ATG et 26 pb après) de la séquence du donneur. La façon dont cela s’est produit n’est pas claire. Dans le #12, il y a deux allèles édités différents, ce qui met le nombre total d’allèles à 3, indiquant un mosaïcisme dans ce porcelet, ce qui n’est pas rare car le mosaïcisme a souvent été trouvé dans les animaux générés par injection zygote de Cas9/sgRNA6,7,8,9,10.
Pour déterminer si un hors-cible s’était produit avec le sgRNA, nous avons choisi 4 sites hors-cible potentiels supérieurs sur la base des suggestions de l’outil de conception CRISPR (http://tools.genome-engineering.org) et amplifié des fragments contenant ces sites à partir de l’ADN génomique de l’extrémité de l’oreille du porcelet n°14. Les fragments ont été soumis au test T4EN I4. Comme le montre la figure S2, aucune édition hors cible n’a été trouvée. Cependant, nous n’avons pas pu éliminer la possibilité que l’édition hors cible se soit produite dans d’autres loci ou chez les 15 autres porcs transgéniques. Néanmoins, même s’il y avait une édition hors cible, il est peu probable que les loci édités soient problématiques pour notre objectif de production de rHSA, tant qu’ils n’interfèrent pas avec le bien-être de ces porcs transgéniques.
Ayant démontré le knockin réussi de l’ALB humaine, nous avons cherché à déterminer si l’albumine humaine pouvait être détectée dans le plasma sanguin de ces porcelets knockin. Comme le montre la figure 2a, tous les porcelets contenaient de l’albumine humaine dans leur plasma sanguin, détectable avec les anticorps spécifiques de l’albumine humaine, bien qu’à des niveaux variables, ce qui est probablement le résultat d’au moins deux facteurs, à savoir si les deux allèles sont knockin et l’étendue du mosaïcisme (en particulier dans le foie). Le niveau dans le #7 est très faible et n’est visible qu’après une longue exposition du buvard, malgré l’absence apparente de l’allèle Alb du porc de type sauvage (Fig. 1a). Globalement, les niveaux sont beaucoup plus faibles que ceux des sérums humains adultes. Il est connu que la concentration d’albumine sanguine chez les porcs augmente avec l’âge, atteignant un niveau similaire à celui des humains adultes à l’âge de 6 mois11.
Analyse de l’ALB humaine dans le sang.
(a) Détection par Western blot de l’albumine humaine dans le sang de porcelets fondateurs. 0,5 μl de plasma de chaque fondateur a été séparé sur SDS-PAGE et analysé. Le plasma de sang humain (0,5 μl après dilution 30 fois) a été utilisé comme contrôle positif. C, plasma d’un porc de type sauvage. (b) Illustration des peptides tryptiques (en vert) détectés avec l’analyse par spectrométrie de masse. (c) Semi-quantitation de deux peptides tryptiques à partir d’albumine humaine et porcine en mesurant les aires de pic de chaque peptide. Le rouge marque les résidus d’acides aminés spécifiques au porc.
Pour confirmer que la rHSA détectée dans le plasma de nos porcelets knockin avec des anticorps est véritablement de l’albumine humaine, nous avons soumis deux échantillons de plasma (porcelet #2 et #6) à une analyse par spectrométrie de masse. Le porcelet #2 est apparemment homozygote pour l’allèle knockin et le #6 contient un allèle knockin et un allèle mutant (frameshift) (Fig. 1). 0,5 μl de plasma a été séparé sur SDS-PAGE et les protéines autour de 70 KD ont été digérées en gel avec de la trypsine. Les peptides tryptiques ont été élués du gel, séchés et redissous pour être séparés par chromatographie liquide et analyse par spectrométrie de masse. Pour le porcelet n°2, nous avons pu détecter 14 peptides tryptiques uniques de l’ALB humaine et 15 pour le n°6 (Fig. 2b). Les spectres M/Z du peptide humain FKDLGEENFK et du peptide porcin FKDLGEQYFK (tous deux issus du porcelet n°2) sont présentés dans la figure S3. Deux peptides ont été choisis pour être quantifiés en mesurant les surfaces des pics. En accord avec les résultats du western blot, ces deux peptides étaient beaucoup plus (~5 fois) abondants dans le porcelet #2 que dans le #6 (Fig. 2c). Ces résultats démontrent que la rHSA détectée par les anticorps est de l’albumine humaine authentique.
Le génotypage de l’ADN isolé des embouts d’oreille indique que tant #2 que #6 ne contiennent aucun allèle Alb porcin de type sauvage, soit absent, soit édité (Fig. 1b,c). Cependant, nous avons encore pu détecter des peptides tryptiques de l’albumine de porc dans les deux échantillons, mais à une abondance beaucoup plus faible (Fig. 2c). Il est intéressant de noter que l’abondance des peptides porcins était à peu près la même entre les deux échantillons, alors que l’abondance des peptides humains était très différente. Ces résultats suggèrent que les deux porcelets contiennent un nombre similaire d’hépatocytes de type sauvage (ou hétérozygote) qui sont responsables de l’ALB porcine détectée dans le sang de ces deux porcelets. Cependant, ces cellules contenant l’allèle sauvage pourraient ne pas exister ou exister dans un pourcentage extrêmement faible dans les extrémités des oreilles, de sorte que l’allèle sauvage ne pourrait pas être amplifié par PCR. De plus, une analyse par transfert de Southern avec une sonde interne (3′ moitié de la CDS de l’ALB humaine) a indiqué la présence d’une insertion supplémentaire de la séquence donneuse chez les porcelets #1, 4 et 5 (Fig. S4). Toutes ces complications ne seront pas un problème dans le but de produire de l’albumine humaine recombinante car l’allèle knockin peut être purifié par rétrocroisement.
Pour déterminer si l’allèle knockin peut être transmis à la génération suivante, nous avons croisé #2 (mâle, homozygote) avec #5 (femelle, hétérozygote) lorsqu’ils sont devenus reproductivement matures. 6 chiots sont nés de ce croisement. 4 d’entre eux (#1, 3, 4 et 6) sont homozygotes pour l’allèle knockin (AlbH/H, H désigne l’homme) et 2 (#2 et 5) hétérozygotes (AlbP/H, P désigne le porc) (Fig. 3a). #5 et 6 sont morts de diarrhée environ 2 semaines après la naissance. Nous avons analysé l’expression de l’albumine humaine dans le sang des porcelets restants à l’âge de 4 semaines. Comme le montre la figure 3b, tous ont de l’albumine humaine dans leur sang. Il est intéressant de noter que le niveau d’albumine humaine chez l’animal hétérozygote (#2) était beaucoup plus faible que chez les homozygotes. Nous ne savons pas si cela résulte d’une variation individuelle ou si l’allèle knockin est en quelque sorte supprimé par l’allèle sauvage.
Transmission germinale de l’allèle knockin.
(a) Génotypage par PCR de la descendance F1. Les amorces utilisées étaient les mêmes que sur la figure 1. (b) Détection par Western blot de l’albumine humaine dans le sang des porcelets F1. 0,5 μl de plasma de chaque porcelet a été séparé sur SDS-PAGE et analysé. C, plasma d’un porc de type sauvage. M, marqueur de poids moléculaire.
Nous montrons ici la génération réussie de porcs portant l’ADNc de l’ALB humaine knocké dans le locus Alb porcin. C’est une étape de plus que la simple édition de gènes dans les zygotes de porc rapportée récemment par Hai et al.12 et nous13. Les grands animaux domestiques ont été utilisés comme bioréacteurs pour les produits protéiques biomédicaux14,15,16,17,18,19,20. Habituellement, les séquences codantes de ces protéines ont été insérées au hasard avec les éléments de contrôle de la transcription nécessaires dans le génome en tant que transgènes, ce qui est associé à de nombreuses complications, notamment la nature à court terme de l’expression du transgène. Notre démonstration que la recombinaison homologue peut se produire très efficacement dans les zygotes de porc ouvre la porte au développement de bioréacteurs toujours plus performants ainsi que de souches d’animaux d’élevage présentant des traits de plus en plus désirables.