Az E-kadherin kötődik a desmogleinhez a deszmoszóma-összeszerelés elősegítése érdekében
1) Ez a cikk a deszmoszóma-összeszerelés kadherin-mediált szabályozásának mechanizmusával foglalkozik. Bár a bírálók egyetértenek azzal, hogy a munka potenciálisan izgalmas, több jelentős kérdést vetettek fel. Először is, mindannyian egyetértenek abban, hogy a modellt tesztelni kell a ko-lokalizáció vizsgálatával a kadherin mutánst expresszáló sejtekben.
Köszönjük a bírálóknak, hogy javasolták ezeket a fontos kísérleteket. Amint azt a bírálóknak adott részletes válaszunkban leírtuk, most teszteltük a különböző Ecad mutációk szerepét a Dsg2 rekrutációjának akadályozásában a keratinocitákban. Teljes hosszúságú Ecad WT-t és Ecad mutánsokat (L175D, K14E és W2A-K14E) expresszáltunk Ecad-knockout, Pcad-knockdown egérkeratinocitákban (EKO/PKD), és elemeztük a Dsg2 rekrutációját a sejtközi kontaktusok helyein. Ezek az eredmények megerősítik, hogy az Ecad L175-ös aminosava közvetíti a Dsg2 kölcsönhatásokat és elősegíti a korai deszmoszóma komplex kialakulását a sejtekben. Kísérleteink azt is megmutatják, hogy a deszmoszóma-összeállítást az Ecad transz-homodimerizáció helyein kezdeményezik.
2) Az 5. ábrán látható kopokalizációs adatok megbízhatóságával kapcsolatban is vannak aggályok; szigorúbb elemzésre van szükség annak bizonyítására, hogy az E-kadherin és a desmoplakin kopokalizációja sokkal gyakrabban fordul elő, mint ahogy az véletlenszerűen várható lenne.
A terepen a deszmoszómákat a DP festés mérete és sínpályás megjelenése alapján azonosítják a SIM-képeken. Amint azt a bírálóknak adott válaszunkban kifejtettük, ezt a bevált megközelítést használtuk a deszmoszómák lokalizálására. Emellett most hangsúlyozzuk, hogy nem kolokalizációt mérünk, hanem a különböző káderinek (Ecad és Dsg) toborzását a membrán azon régióiba, amelyek ezt a mintázatot mutatják.
3) Másodszor, a modellezés feltételezi, hogy az L175 a határfelület részét képezi, de a sztöchiometria értékelése nélkül nem zárható ki, hogy a kötődés elvesztése a cisz-dimerizáció elvesztésének közvetett hatása. A modellezés azért is tekinthető gyengének, mivel a Dsg2-n nem vizsgáltunk komplementer interfészeket. Ilyen adatok nélkül a molekuláris modellezést erősen spekulatívnak kell tekinteni.
Amint azt a bírálóknak adott részletes válaszunkban leírtuk, korábbi számítógépes szimulációk és biofizikai kísérletek azt mutatják, hogy az Ecad cisz-dimer kialakulásához előzetes transz-dimerizáció szükséges. Következésképpen az Ecadok nem tudnak önálló, előre kialakított cisz-dimerekként kötődni a felszínhez. Ez rendkívül valószínűtlenné teszi, hogy a mért kötési kölcsönhatások az Ecad cisz-dimerek és a Dsg2 között lépjenek fel. Mindazonáltal egyetértünk a bírálókkal abban, hogy a molekuláris dokkolási eredmények meglehetősen gyengék. Ezért ezeket a modellezési eredményeket eltávolítottuk a kéziratból.
4) Végül, ahogy a 3. bíráló megjegyezte, még ha ezek a kiegészítések támogatják is, a modell és a Megbeszélés rész nem igazán magyarázza meg, hogyan szabályozza az E-kadherin a deszmoszómákat.
Az új sejtszerkezet-funkciós adataink alapján most egy olyan modellt javasolunk, amelyben a deszmoszóma-összeszerelődést mind az Ecad és a Dsg2 közvetlen cisz kölcsönhatásai, mind az ellentétes Ecad transz kötődése elősegíti. Modellünkben az ellentétes sejtekből származó Ecad transz homodimerizációja térbeli jelként szolgál a deszmoszóma összeszerelés koordinálásához. Az Ecad ezt követően cisz-dimer komplexeket képez a Dsg2-vel a deszmoszóma-összeszerelés elindításához. A modellt az új kéziratban mutatjuk be és tárgyaljuk.
Kritikus #1:
1) Az egymolekulás AFM kísérletek a dolgozat legszilárdabb része. Az én olvasatomban azonban a szerzők nem zárják ki annak lehetőségét, hogy az általuk megfigyelt kötődési események az előre kialakult E-kadherin cisz-dimerek közötti kölcsönhatásokból adódhatnak. A kölcsönhatás sztöchiometriájának megállapítása fontos, mivel ha a Dsg2-hez való kötődéshez egy E-kadherin cisz-dimerre lenne szükség, az megváltoztatná annak az eredménynek az értelmezését, hogy az L175D mutáció blokkolja a Dsg2/E-cad kölcsönhatást. Egy ilyen forgatókönyv a dokkoló szimulációk érvényességét is megkérdőjelezné. Az én olvasatomban a kötődés alacsony valószínűsége az AFM-csúcs és a felület érintkezésénként gyenge bizonyíték arra, hogy a kötődés szükségszerűen két monomer kölcsönhatását tükrözi, ahogy a kadherin molekulák alacsony átlagos sűrűsége sem a felületen. Továbbá a káderineket sztreptavidinnel immobilizálták, amely több biotin-kötőhellyel rendelkezik.
Ezek miatt úgy gondolom, hogy fontos annak bizonyítása, hogy a monomerek között heterodimerizáció történik. Ehhez javasolnám a hegynek a felülettel való kölcsönhatási valószínűségének szisztematikus mérését a fedőlap felületén lévő E-kadherin területi felületi sűrűségének függvényében. Ha a kölcsönhatáshoz valóban monomer E-kadherinre van szükség, akkor ennek a mérésnek lineárisan kell skálázódnia a hozzáadott E-kadherinnel, legalábbis alacsony sűrűségnél. Ez a konkrét mérés azonban nem szükséges – bármilyen mérés, amely megállapítja a sztöchiometriát, elegendő.
A korábbi számítógépes szimulációk (Wu et al., 2010; Wu et al., 2011) azt mutatták, hogy az Ecad cis homodimerizációhoz előzetes Ecad transz-dimer képződés szükséges. Hasonlóképpen, korábbi egymolekulás FRET mérések azt mutatták, hogy nem lehetséges önálló Ecad cis-dimerek képzése, még akkor sem, ha az Ecad monomerek cis orientációban, egymáshoz közel helyezkednek el (Zhang et al., 2009). Ezek az eredmények együttesen arra utalnak, hogy a mi kísérleteinkben az Ecadokat nem lehet előre kialakított cisz-dimerekként immobilizálni az AFM csúcson vagy a szubsztráton. Következésképpen az Ecad-L175D mutánsnak a Dsg2-vel való kölcsönhatási kudarca nem az Ecad cisz-dimerizáció hiányának köszönhető. Ezt most a kézirat “Leu 175 mediates Ecad and Dsg2 interactions” alfejezetében tárgyaljuk.
A technikai korlátok sajnos nem teszik lehetővé a bíráló által javasolt fehérje sztöchiometriai kísérletet. Kísérleteinkben olyan fehérjefelületi sűrűségeket használunk, amelyek lehetővé teszik, hogy a PEG téterek megfelelő megnyúlásaiból egyértelműen azonosítsuk az egyes kötődési eseményeket. Ha a káderin felületi sűrűségét növeljük, ahogyan azt a recenzens javasolja, az egyidejűleg több Ecad kötődési esemény valószínűsége megnő, ami megbízhatatlanná teszi a fehérjekötődés valószínűségének kvantitatív elemzését. Emiatt (a dokkolási elemzésünk belső gyengeségével együtt) a fehérjék dokkolási szimulációit kizártuk a kéziratból.
Végezetül, a felülvizsgált kéziratban most már klaszterelemzést használunk az egymolekulás kötésbontási események csoportosítására a dinamikus erőspektroszkópiához (DFS). Nemrégiben kimutattuk, hogy az általunk alkalmazott K-means klaszterező algoritmus jelentősen javítja a kinetikai paraméterek becslését a DFS-ben (Yen és Sivasankar, 2018). Következésképpen az Ecad/Dsg2, Dsc2/Dsg2 és Dsc2/Dsc2 kölcsönhatásokra vonatkozóan most közölt élettartamok megbízhatóbbak.
2) A dokkolási szimulációk érdekesek, de véleményem szerint gyenge bizonyítékot nyújtanak a szerzők által javasolt specifikus kötési geometriára. Nyomatékosan javaslom, hogy a szerzők legyenek óvatosabbak ezen eredmények értelmezésében és bemutatásában, vagy alternatívaként mutassanak be további adatokat, például EM-felvételeket, amelyek alátámasztják vagy cáfolják a számítási eredményt.
Egyetértünk a véleményezővel abban, hogy a fehérjék dokkolási adatai gyengék. Ezért ezeket az eredményeket töröltük a kéziratból.
3) Sajnos a SIM-képek a jelenlegi formájában nem meggyőzőek. Különösen nem világos, hogy mi számít “deszmoszómának” a szerzők elemzésében (5B ábra). A kolokalizáció kifinomultabb kezelésére lenne szükség annak megállapításához, hogy az E-kadherin és a desmoplakin kolokalizálódik, és hogy ez a kolokalizáció a csomópontok érésével csökken.
A korábbi tanulmányokban (Stahley et al., 2016a, 2016b) a DP szuperfelbontású képalkotás által feltárt “sínpályás” megjelenését használtuk fel a desmoszómák immunfluoreszcenciás meghatározásához (ahogy a 3A ábrán látható). A területen mások is használták a “vasúti pálya” morfológiát a deszmoszómák SIM-felvételeken történő azonosítására (lásd pl: Chen et al., (2012); Ungewiß et al., (2017)). Ezeknek a struktúráknak a SIM által feltárt mérete és szerveződése teljes mértékben megfelel a deszmoszómák klasszikus EM-definícióinak. Ezeken a struktúrákon belül a két káderin (Ecad vagy Dsg2) pixelintenzitását standard képelemzéssel mértük. Fontos, hogy nem kíséreltünk meg ko-lokalizációt állítani. Inkább a káderin rekrutációját mérjük olyan membrándoménekben, amelyek DP sínpálya festődési mintázatot mutatnak. Tisztában vagyunk azzal, hogy a korai időpontokban néha nehéz megkülönböztetni a sínpályákat. Ezért úgy éreztük, hogy a legkorábbi időpont, amikor úgy éreztük, hogy azonosítani tudjuk a jóhiszemű sínpálya-festődést, az 1 óra volt. Továbbá csak olyan helyeken végzünk méréseket, ahol vasúti nyomvonal-mintázatokat tudunk megfigyelni, nem pedig DP punctákat. Végül, az a megállapításunk, hogy az Ecad jelen van a kialakuló deszmoszómákban, összhangban van a klasszikus immun-EM kísérletekkel, amelyek azt mutatják, hogy az Ecad képes a deszmoszómákba lokalizálódni (Jones, 1988). Ezért bízunk abban, hogy képesek vagyunk a desmosomák azonosítására és a két káderin relatív szintjének mérésére különböző időpontokban.
4) Ezt az utolsó pontot a szerkesztő belátására bízom. Véleményem szerint a kolokalizációs adatok, még ha igaznak is vesszük őket, nem állapítanak meg funkcionális relevanciát. Nagyon jó lenne látni egy knockdown/rekonstitúciós kísérletet az L175D E-kadherinnel. Az előrejelzés szerint ez a molekula soha nem kolokalizálódna a desmoplakinnal, függetlenül a csomópont korától. Ennek az előrejelzésnek a megsértése kétségbe vonná a szerzők által favorizált modellt.
A recenzens javaslata alapján most kísérleteket végeztünk, hogy közvetlenül teszteljük a különböző Ecad extracelluláris domén mutációk szerepét a DP és a Dsg2 rekrutációjának akadályozásában keratinocitákban. Ezeket az adatokat az “Ecad L175 nélkülözhetetlen a hatékony intercelluláris Dsg2 rekrutációhoz és a deszmoszóma összeszereléshez” alfejezetben ismertetjük. A megfelelő képek az 5. ábrán és az 5. ábra 5. ábra 1. kiegészítésében láthatók. Az alkalmazott módszereket a “Primer keratinociták izolálása, tenyésztése, transzfekciója és konfokális képalkotása” című alfejezet ismerteti. A kísérletekhez EKO/PKD egérkeratinocitákat használtunk, amelyek gyakorlatilag nem expresszálnak klasszikus kadherineket. Korábban kimutattuk, hogy ezek az EKO/PKD keratinociták az összes klasszikus kadherin elvesztése miatt nem képesek AJ-k és deszmoszómák összeszerelésére (Michels és mtsai., 2009). Ezek a sejtek így lehetővé teszik számunkra, hogy közvetlenül értékeljük az Ecad mutánsok i) AJ-képződés megindításának képességét és ii) a deszmoszóma komponensek rekrutálásának képességét a kezdeti sejt-sejt kontaktus kialakulásának helyére.
Mivel az Ecad mutánsok deszmoszómális fehérjék rekrutálására való képességének értékelése érdekelt bennünket a csomópontképződés korai szakaszában, ezért teljes hosszúságú Ecad WT vagy mutánsokat expresszáltunk EKO/PKD keratinocitákban, és konfokális mikroszkópiával elemeztük a DP és a Dsg2 rekrutálódását a sejtek közötti kontaktusok helyére. A csomópontok kialakulásának és érésének különböző szakaszaiban történő rekrutáció vizsgálatához keratinocitákat rögzítettünk, és a Ca2+ kapcsolást követő három időpontban (3 óra, 6 óra és 18 óra) DP, Dsg és Ecad immunfestést végeztünk.
Az adataink azt mutatták, hogy 3 órával a Ca2+ kapcsolás után a WT-Ecad 93%-a feldúsult a cipzárszerű korai AJ-kben a sejtek közötti kapcsolatok helyein. Ezzel szemben az L175D-Ecad transzfektált keratinocitáknak csak 48%-a képzett AJ cipzárakat, valószínűleg a károsodott Ecad cis-dimer képződés miatt (5. ábra A, B). A Ca2+ kapcsolást követő korai időpontokban a WT-Ecad zipper-kapcsolatok 66%-a és 91%-a volt pozitív a Dsg2 és a DP szempontjából (5. ábra A, C, D, E). Amikor a sejtek 18 órán keresztül Ca2+-függő intercelluláris adhéziót folytattak, az Ecad-Dsg2 és az Ecad-DP csomóponti lokalizációja 97%-ra, illetve 100%-ra nőtt (5. ábra A, C, D, E). Ezzel szemben az L175-indukált cipzáras kapcsolatoknak csak 39%-a mutatott Dsg2-rekriminációt 3 órával a magas Ca2+-ra való átállás után, ami 18 órára 65%-ra nőtt (5. ábra A, C), megerősítve, hogy az Ecad és a Dsg2 közötti közvetlen kölcsönhatás szükséges a Dsg2 hatékony rekrutációjához a korai intercelluláris kapcsolatokhoz. Hasonlóképpen, 3 óra elteltével az L175D-Ecad mutáns által létrehozott intercelluláris kapcsolatoknak csak 28%-a volt pozitív DP-re, ami 18 óra elteltével 72%-ra nőtt, ami egy kompenzációs mechanizmusra utal a későbbi szakaszokban (5. ábra D, E).
Azért, hogy megerősítsük, hogy az L175D mutáció megfigyelt hatása nem az akadályozott AJ-képződésnek köszönhető, az EKO/PKD keratinocitákat transzfektáltuk a teljes hosszúságú Ecad-K14E mutánssal, amely megszünteti az X-dimer képződést és az Ecad-ot szálcserés dimer-konformációban tartja. Adataink azt mutatták, hogy a magas Ca2+-ra való átállást követő korai (3 óra) időpontokban a transzfektált kontaktáló sejteknek csak 4%-a képzett zippert, és a késői (18 óra) időpontokban a transzfektált kontaktáló sejteknek csak 24%-a mutatott zippert (5. ábra A, B, 5. ábra – 5. ábra kiegészítő 1), ami megerősíti, hogy a K14 elengedhetetlen a hatékony AJ-képződéshez, és így a sejtek közötti kontaktus kialakulásához. Azonban az a néhány K14E AJ, amely kialakult, hatékonyabban rekrutálta a Dsg2-t és különösen a DP-t, mint az L175D (5. ábra A, C, E, 5. ábra 5 ábra – kiegészítő ábra 1). Ez az eredmény megerősítette, hogy a Dsg2 késleltetett rekrutációja a sejtek közötti kontaktusokhoz nem annak az eredménye, hogy az Ecad L175D nem képes hatékonyan AJ-ket képezni, hanem inkább az Ecad és a Dsg2 közötti közvetlen kölcsönhatás hiánya miatt. Mivel a DP és az Ecad ko-lokalizációja zipperek hiányában soha nem volt tapasztalható (5. ábra – 1. ábra kiegészítő ábra), az adatok arra is utalnak, hogy az Ecad transz kölcsönhatások megelőzik az Ecad/Dsg2 kölcsönhatásokat. Ezt a következtetést tovább erősíti az a megállapításunk, hogy a teljes hosszúságú Ecad-DM (W2A-K14E kettős mutáns, 5. ábra, kiegészítő 1. ábra) EKO/PKD keratinocitákban történő transzfektálásával az Ecad transz adhézió és így a zipperek megszüntetésével nem figyeltünk meg DP-rekriminációt. Összességében ezek az eredmények megerősítik, hogy az L175 aminosav közvetíti a Dsg2 kölcsönhatásokat és elősegíti a korai deszmoszóma komplex kialakulását a sejtekben.
Véleményező #2:
1) Érdekes az a megállapítás, hogy az E-kadherin L175 maradék kritikus a Dsg2-vel való kölcsönhatás szempontjából. Azonban nem azonosítottunk interakciós partner maradékot. Ilyen körülmények között az E-kadherin/Dsg2 kölcsönhatás konformációjának dokkolással történő előrejelzése bizonytalannak tűnik; bizonytalannak tűnik, hogy a megjósolt konformáció a valódi kötött konformációra vonatkozik.
Egyetértünk a recenzenssel abban, hogy a fehérjék dokkolási adatai spekulatívak, ezért ezeket az eredményeket töröltük a kéziratból.
2) A javasolt Dsg2/E-kadherin kölcsönhatás csak gyenge kapcsolatban áll a deszmoszóma-összeszerelés biológiájával. Mégis úgy tűnik, hogy a szerzőknek világos útjuk van. Azzal érvelnek, hogy az E-kadherin jelenléte a kialakuló deszmoszómákban (kísérleti úton a desmoplakinra történő együttes festéssel értékelve az 5. ábrán) bizonyíték az általuk azonosított Dsg2/E-kadherin társulás szerepére. Most, hogy azonosítottak egy olyan mutánst, amely megakadályozza ezt a társulást, a mutánssal végzett 5. ábra kísérleteinek más eredményekre kell vezetniük. Ez a kísérlet lényegesen növelné a dolgozat szigorúságát.
Az 1. véleményezőnek adott 4. válaszban leírtak szerint teljes hosszúságú Ecad WT és Ecad mutánsokat expresszáltunk EKO/PKD keratinocitákban, és elemeztük a Dsg2 és a DP rekrutációját a sejtközi kontaktusok helyein. Ezek az eredmények megerősítik, hogy az L175 aminosav közvetíti a Dsg2 kölcsönhatásokat és elősegíti a korai deszmoszóma-komplex kialakulását a sejtekben. Ezeket az adatokat a kézirat “Az Ecad L175 esszenciális a hatékony intercelluláris Dsg2-rekriminációhoz és a deszmoszóma-összeállításhoz” alfejezetében ismertetjük. A megfelelő képek az 5. ábrán és az 5. ábra 5. ábra 1. kiegészítésében láthatók. Az alkalmazott módszereket a “Primer keratinociták izolálása, tenyésztése, transzfekciója és konfokális képalkotása” című alfejezetben ismertetjük.”
Véleményező #3:
1) Ez a kézirat izolált fehérjék segítségével azonosítja és jellemzi az E-kadherin és a Desmoglein 2 közötti molekuláris kölcsönhatást, és kimutatja e két molekula fokozott kolokalizációját a keratinocitákban a desmoszóma összeszerelés korai szakaszában. Ezek potenciálisan nagyon érdekes megfigyelések, amelyek megmagyarázhatják, hogy a klasszikus káderinek hogyan szabályozzák a deszmoszómák összeszerelését. Bár ezt több csoport is jól dokumentálta az irodalomban, a mögöttes mechanizmusok még mindig többnyire ismeretlenek. Azonban a “Integrált egymolekulás kísérleteink, fehérje-fehérje dokkolási előrejelzéseink és sejtalapú szuperfelbontású képalkotásunk azt mutatja, hogy az Ecad/Dsg2 kölcsönhatások fontos szerepet játszanak a korai deszmoszóma-összeszerelésben” című következtetésük, amelyet a Megbeszélés rész elején állítanak, meglehetősen erős túlzás, tekintve, hogy a kölcsönhatás izolált extracelluláris doméneken és statikus, bár nagy felbontású mikroszkópián alapuló jellemzésen alapul. Nem végeztek kísérletet annak kimutatására, hogy ha valaki megzavarja ezt a kölcsönhatást, akkor a deszmoszóma összeszerelése valóban károsodik, ami véleményem szerint a minimum lenne ahhoz, hogy ez az adatsor valóban érdekessé és relevánssá váljon a széles közönség számára.
Az 1. véleményezőnek adott 4. válaszban leírtak szerint most teljes hosszúságú Ecad WT és Ecad mutánsokat expresszáltunk EKO/PKD keratinocitákban, és kimutattuk, hogy az L175 aminosav közvetíti a Dsg2 kölcsönhatásokat és elősegíti a korai deszmoszóma képződést a sejtekben, amit a DP rekrutációval értékeltünk. Ezeket az adatokat a kézirat “Az Ecad L175 nélkülözhetetlen a hatékony intercelluláris Dsg2-rekriminációhoz és a deszmoszóma-összeszereléshez” című alfejezetében ismertetjük. A megfelelő képek az 5. ábrán és az 5. ábra 5. ábra 1. kiegészítésében láthatók. Az alkalmazott módszereket a “Primer keratinociták izolálása, tenyésztése, transzfekciója és konfokális képalkotása” című alfejezetben ismertetjük.”
2) Annak fényében is, hogy a kölcsönhatás kalciumfüggetlen, míg a klasszikus káderinfüggő korai deszmoszóma-összeszereléshez kalcium jelenléte szükséges (amit egyáltalán nem tárgyalunk).
Köszönjük a recenzensnek ezt az éleslátó megjegyzést. Ahogyan az “Az Ecad L175 nélkülözhetetlen a hatékony intercelluláris Dsg2 rekrutációhoz és a deszmoszóma összeszereléshez” alfejezetben leírtuk, az egér keratinocitákban expresszált mutáns Ecad konfokális képalkotása most azt mutatja, hogy a deszmoszóma összeszerelés a Ca2+ függő Ecad transz homodimerizáció helyein indul meg. Adataink alapján egy olyan modellt javasolunk, amelyben a deszmoszóma összeszerelődést mind az Ecad és a Dsg2 közvetlen cisz kölcsönhatása, mind az ellentétes Ecad transz kötődése elősegíti. Modellünkben az ellentétes sejtekből származó Ecad transz homodimerizációja térbeli jelként szolgál a deszmoszóma összeszerelés koordinálásához. Az Ecad ezt követően cisz-dimer komplexeket képez a Dsg2-vel. Miután lokalizálódott a natív deszmoszómán belül, a Dsg2 disszociál az Ecadról és kötődik a Dsc2-hez, hogy érett deszmoszómákat képezzen. Mivel a Dsc2/Dsg2 komplex élettartama hosszabb, mint az Ecad/Dsg2 komplexé és a Dsc2/Dsc2 komplexé, ez valószínűleg lehetővé teszi a sejt-sejt adhéziót, és lehetővé teszi, hogy az érett deszmoszóma ellenálljon a mechanikai erőnek. Ezt a modellt a 6. ábra és a Megbeszélés rész ismerteti.
3) Mivel ez egy teljesen új, alacsony affinitású kölcsönhatás, valószínűleg nehéz olyan sejtek környezetében kölcsönhatási vizsgálatokat végezni, amelyekben az egyik sejt E-cadherint, a másik Dsg2-t expresszál, hogy megvizsgáljuk, van-e kölcsönhatás. Mivel azonban az adataik részben modellezésen alapulnak, a szerzőknek egy olyan mutánst is elő kellene állítaniuk, amelyben az A125 és az A124 mutálódik, hogy sokkal jobban bizonyítsák az y-dimerek javasolt létezését.
Mivel a fehérje dokkolási eredmények nem robusztusak, ezért ezeket az adatokat most kiiktattuk a kéziratból. Ugyanakkor az EKO/PKD keratinocitákkal végzett kísérleteink, amelyek azt mutatják, hogy az Ecad L175 aminosavának mutációja az Ecad-on károsítja a Dgs2 és különösen a DP rekrutációját a korai kontaktusképződés helyein, azt bizonyítja, hogy az Ecad-L175 elősegíti a sejtekben a deszmoszóma kialakulását, megerősíti biofizikai eredményeinket.
Összefoglalás:
A bírálók úgy vélik, hogy bár a biofizikai adatok meggyőzőek, szigorúbb mennyiségi elemzésre van szükség a 3. és 5. ábrán szereplő adatokból levont következtetések alátámasztásához. Elvileg ezeket az aggályokat nem kísérletekkel, hanem további adatelemzéssel lehet kezelni, és ebben az esetben megfontolnánk egy átdolgozott kézirat benyújtását.”
Köszönjük a szerkesztőnek ezt a bátorító véleményt. Az alábbiakban leírtak szerint a felülvizsgált kéziratunk az összes kiemelt kérdéssel foglalkozik.
1) A következtetés, miszerint az E-cadherin-Dsg kölcsönhatás szükséges a kezdeti deszmoszóma kialakuláshoz, a Dsg és az E-cadherin kolokalizációjának csökkenésén alapul, ahogy a csomópont érik. A 3. ábrán azonban nem egyértelmű, hogy a DP-vel megfigyelt kolokalizáció a véletlenszerűen vártnál jelentősebb, vagy az E-cadherin szubcelluláris lokalizációjának időfüggő, a csomópont érésétől független változásaiból ered. A 3C. ábrán a jobb oldali panelben látható kontrollkísérletek a Dsg2 és a DP – ismert Desmosome komponensek – kolokalizációját emelik ki, és a fluoreszcenciajelek szoros egyezését mutatják mindhárom időpontban. Ezzel szemben, míg a bal oldali paneleken az E-kadherin és a DP expressziója bizonyos mértékig átfedésnek tűnik, ezek nem mutatják a kontrollkísérleteknél megfigyelt jelek közötti megfelelést. Az e témával kapcsolatos eredeti felülvizsgálati pontokra adott válasz (pl. 1. bíráló, 3. pont) a deszmoszóma meghatározására összpontosít, de nem foglalkozik a fenti ponttal.
Meg szeretnénk tisztázni, hogy nem a ko-lokalizációt mérjük, hanem az Ecad vagy a Dsg2 toborzását a membrán olyan régióiba, amelyek DP “vasúti pálya” mintázatot mutatnak. Hogy ezt egyértelműbbé tegyük, most módosítottuk a felülvizsgált kéziratot, hogy hangsúlyozzuk, hogy az Ecad “feldúsul a kialakuló deszmoszómákban”, nem pedig “kizáródik az érett deszmoszómákból”.
A bírálóknak az Ecad deszmoszómákban való feldúsulásának mérésével kapcsolatos aggályaira közvetlenül válaszolva most megmutatjuk, hogy az Ecad relatív szintje a teljes sejthatár mentén (Ecad:DP arány a sejthatáron) idővel változatlan marad. Ezek az adatok megerősítik, hogy a korai időpontokban a DP sínpályákon belüli Ecad-dúsulás a membrán desmosomális régióira specifikus, és jelentős mértékben meghaladja azt, amit véletlenszerűen vagy az E-kadherin lokalizációjában bekövetkező, a csomópontok érésétől független változások miatt várnánk. Az adatokat a 3. ábra 1. ábra-kiegészítésében mutatjuk be, és az “Ecad jelen van a nazcens desmosomákban, de nem az érett desmosomákban” alfejezetben ismertetjük.”
Végezetül, mivel a 3. ábrán látható vonalfelvételek zavaróak voltak, a vonalfelvételeket eltávolítottuk a felülvizsgált kéziratból. Ehelyett a 3B. ábrán most több reprezentatív képet mutatunk a magas Ca2+ tartalmú közegben 1, 3 vagy 18 órán keresztül tenyésztett humán keratinociták deszmoszómás régióiról. Ezek az eredmények hangsúlyozzák a 3C. ábra fő “tanulságos” üzenetét: Az Ecad szintek feldúsulnak a kialakuló deszmoszómákban, a relatív szintek pedig csökkennek a deszmoszómák érésével.
2) Hasonló aggályok merültek fel az 5. ábrával kapcsolatban, amely azt hivatott bemutatni, hogy az Ecad L175 nélkülözhetetlen a hatékony intercelluláris Dsg2 rekrutációhoz és a deszmoszómák összeszereléséhez. Az A panel képei valóban drámai különbséget mutatnak a Dsg2 és a DP lokalizációjában a WT vagy mutáns káderinhez képest. Míg a Dsg2 és a DP ko-lokalizál a WT vagy K14E Ecaddal a csomópontoknál, addig az L175D Ecad csomópontot flankáló külön punctákban maradnak, és nem ko-lokalizálnak vele. Nem világos azonban, hogy a szerzők mit számszerűsítettek ennek a fenotípusnak a jelentőségét vizsgálva. A B-ben mi az a “kapcsolatokat alkotó csomópontok %-ában”? Hogyan definiálják a kontaktust? Milyen csomópontokat mérnek? AJ vagy deszmoszómákat? C-ben és E-ben mit értenek a Dsg2- vagy DP-pozitív csomópontok %-án? Hogyan definiálták a csomópontokat?
Most egy ábrapanelt (5. ábra – 5. ábra, 1A kiegészítés) adtunk hozzá, hogy bemutassuk az elemzésünkben használt számszerűsítési kritériumokat és csomóponti kategóriákat. Ez a panel példákat mutat olyan Ecad mutánssal transzfektált sejtekre, amelyek nem (bal oldali panel) vagy igen (jobb oldali panel) mutatnak sejtközi AJ-képződést. A Dsg2 vagy DP rekrutáció esetében csak azokat az intercelluláris interfészeket számszerűsítettük, amelyekben AJ cipzárakat figyeltünk meg. Az ábrapanel betétjeiben olyan AJ pozitív kontaktusokra mutatunk példákat, amelyek DP-re pozitívak vagy DP-re negatívak.
A kézirat “Az Ecad L175 nélkülözhetetlen a hatékony intercelluláris Dsg2-rekriminációhoz és a deszmoszóma-összeszereléshez” alfejezetében most azt állítjuk, hogy a transzfektált keratinociták AJ-képződési képességét először az Ecad “cipzárszerű” mintázatainak kialakulását vizsgáltuk a sejtközi kontaktusokban. Korábban kimutattuk, hogy ezek a cipzárak korai AJ-ket képviselnek, és olyan AJ-markerfehérjéket toboroznak, mint a vinculin (Rübsam és mtsai., 2017). Csak az AJ zipperekkel rendelkező intercelluláris interfészeket vizsgáltuk, hogy képesek-e Dsg2-t és DP-t toborozni ezekhez a kontaktusokhoz. Fontos, hogy AJ zipperek hiányában soha nem figyeltük meg a deszmoszómális komponensek gazdagodását a sejtközi kontaktusokban (Michels et al., 2009).
A 3a válaszban leírtak szerint most a Megbeszélés részben tárgyaljuk, hogy bár a Dsg2 és a DP 3 órán belül mutat némi ko-lokalizációt az Ecad-pozitív zippereknél, nem átfedő csomóponti festődés is van, ami arra utal, hogy az AJ-k és a deszmoszómák már kezdenek elkülönülni a különálló sejtközi csomópontokban. Ezt a ko-lokalizációt nem számszerűsítettük a kéziratunkban, mivel kísérleteink fő célja az volt, hogy megmutassuk az L175 jelentőségét a Dsg2 intercelluláris interfészekhez való rekrutálásában és a deszmoszóma kialakulásának elősegítésében (ahogy azt a DP intercelluláris kontaktusokhoz való rekrutálása is mutatja). Úgy gondoljuk, hogy a WT, az L175 mutáns és a K14 mutáns közötti rekrutáció késleltetése, amelyet az 5. ábrán számszerűsítettünk, jól illusztrálja ezt a pontot.
3) A Bevezetés és a Megbeszélés részben is módosításokra van szükség a fenti pontok, valamint a dolgozat hozzáférhetősége érdekében:
a) A fenti pontokhoz kapcsolódóan az in vitro kötési kísérletek és a javasolt biológiai szerep közötti kapcsolat gyengének tűnik a lokalizációs vizsgálatok alapján, amelyek átfedő, de nem valóban ko-lokalizált festési mintázatokat mutatnak. A szerzőknek meg kell magyarázniuk ezt az eredményt; talán a ko-lokalizáció dinamikus, és/vagy az E-cadherin molekuláknak csak egy részhalmaza kötődik a Dsg2-hez. Legalább ezt a pontot meg kell vitatni, hogy a lokalizációs kísérletek eredményeit racionalizálni lehessen a javasolt modellel.
Az Ecad/Dsg2 kölcsönhatások átmeneti jellege miatt a csomópontokhoz rekrutált deszmoszómális fehérjék várhatóan gyorsan elkülönülnek az Ecad-tól. Következésképpen az intercelluláris interfészek képein várhatóan átfedő és különálló Ecad és deszmoszómális fehérjék festődési mintázata egyaránt megtalálható. Egyetértésben, bár a Dsg2 és a DP némi ko-lokalizációt mutat az Ecad-pozitív cipzáraknál (5. ábra), jelentős nem átfedő csomóponti festődés figyelhető meg, még az első 3 órában is. Ez arra utal, hogy az AJ-k és a deszmoszómák gyorsan elkülönülő intercelluláris csomópontokká válnak. Ezt most a Megbeszélés részben közöljük.
b) A Megbeszélés rész elején a szerzők azt állítják, hogy: “két kritikus eseményt azonosítottak, amelyek elindítják és elősegítik a hatékony deszmoszóma-összeszerelődést: (i) az Ecad stabil transz homodimerizációját, és (ii) az Ecad és a Dsg2 ektodomének közvetlen heterofil kötődését. Adataink azt mutatják, hogy a deszmoszóma-összeszerelés az Ecad transz-homodimerizáció helyein indul meg. Ezt követően az Ecad és a Dsg2 az Ecad cisz kötőfelületén lévő konzervált Leu 175-en keresztül kötődnek, és rövid életű heterofil komplexeket alkotnak, amelyek a korai deszmoszómákhoz lokalizálódnak, és hatékonyan toborozzák a deszmoszómális fehérjéket a sejtek közötti kapcsolat kialakulásának helyeire. Ahogy a deszmoszómák érnek, a Dsg2 disszociál az Ecadról és stabil kötéseket képez a Dsc2-vel a robusztus adhézió közvetítése érdekében”. – Ez a bekezdés keveri a megfigyeléseket, az értelmezést és a hipotetikus modelleket, és mint ilyen félrevezető. El kellene különíteniük az eredmények összefoglalását az értelmezéstől és a modelljüktől.”
A bírálók javaslatára a Megbeszélés rész első bekezdéséből eltávolítottuk az értelmezéseket, és most már csak az eredményeket foglaljuk össze.”
c) A szerzők az Absztraktban és a Bevezetésben azt írják, hogy “Az Ecad az Ecad cisz kötőfelületén lévő konzervált Leu 175-en keresztül lép kölcsönhatásba a Dsg2-vel”. – A szerzőknek nem kellene feltételezniük, hogy az olvasók ismerik az E-cad homofil kölcsönhatásokat, és ezt kifejezetten el kellene magyarázniuk.
Az Absztraktban most azt írjuk, hogy “Korábbi tanulmányok azt mutatják, hogy az E-cadherin (Ecad), egy adhéziós fehérje, amely transz és cisz konformációban is kölcsönhatásba lép, egy ismeretlen mechanizmuson keresztül elősegíti a desmosom összeszerelődést.”
Továbbá a Bevezetésben most azt írjuk: “Mivel az Ecad laterálisan kölcsönhatásba lép, hogy cis-dimereket képezzen ugyanazon a sejtfelszínen (Harrison et al., 2011), míg a szemben lévő sejtek Ecad molekulái transz szálcserés dimer-konformációban lépnek kölcsönhatásba (Boggon et al., 2002; Parisini et al., 2007; Vendome et al., 2011) és egy transz X-dimer konformációban (Ciatto et al., 2010; Harrison et al., 2010), olyan mutánsokat használtunk, amelyek specifikusan megszüntetik az Ecad transz vagy cisz kölcsönhatásokat, és teszteltük a Dsg2-hez vagy a Dsc2′ -hez való kötődésüket. Végül a bevezetőben most már azt állítjuk, hogy “Korábbi szerkezeti vizsgálatok kimutatták, hogy az L175 közvetíti a homofil Ecad cis dimerizációt (Harrison és mtsai., 2011).”
https://doi.org/10.7554/eLife.37629.013