Deuterált kloroform
13.4.4 A műszer teljesítményének értékelése és karbantartása
A laboratóriumi műszerek beépítése a laboratóriumi minősítésekhez használt minőségirányítási rendszerekbe (pl. ISO17025 analitikai laboratóriumok esetében) megköveteli a műszer teljesítményének rendszeres időközönkénti értékelését és karbantartását. Ezek a tanúsítások lehetővé teszik a laboratóriumi analitikusok számára, hogy a műszer tervezett felhasználása köré működési minősítési (OQ) és teljesítményminősítési (PQ) teszteket készítsenek. Így az NMR esetében az OQ/PQ tesztek a műszeren elvégzendő általános analitikai vizsgálatoktól függően változhatnak. A modern műszerek automatikus eljárásokkal rendelkeznek, amelyekhez a felhasználónak be kell helyeznie a megfelelő mintát, majd egy sor vizsgálatot kell automatizált módon elvégezni. E tesztek végén egy jelentést állítanak ki, amely lehetővé teszi a felhasználó számára, hogy értékelje a spektrométer általános teljesítményét.
A vizes oldatokban lévő fehérjeterapeutikumok vizsgálatához ezeknek az OQ-teszteknek tartalmazniuk kell: hőmérséklet-kalibrációt, az aceton jelének vonalképét deuterált kloroformban, az etilbenzol jelének érzékenységét deuterált kloroformban és/vagy vízszuppressziót a 2 mM szacharózoldat anomerikus protonjainak érzékenységi értékelésével. A hőmérséklet-kalibrálás azért fontos, mert a fehérje dinamikáját befolyásolják a környezeti oldat körülményei, ami nagy hatással lehet a megfigyelt jelvonalsávszélességekre és frekvenciákra. Az NMR-spektrométerekben a minta hőmérsékletének szabályozása a szonda levegő hőmérsékletének és áramlási sebességének gondos szabályozására támaszkodik. A szondalevegőnek a minta hőmérsékletére gyakorolt hatása 100%-os metanolos vagy 100%-os etilénglikolos oldat kémiai eltolódásainak mérésével mérhető. Ezeket az eltolódásokat gondosan megmérték, így a minta tényleges hőmérséklete egy adott szondaléghőmérséklet és áramlási sebesség beállítása mellett értékelhető.
A jó mintasimítás (azaz a minta megfigyelt részén egyenletes mágneses tér) hatását a spektrum minőségére nem lehet eléggé hangsúlyozni: minél keskenyebbek a csúcsok, annál jobb a mérendő jelek felbontása és érzékenysége. Különösen, ha jelelnyomási technikákat alkalmaznak, minél keskenyebb az elnyomandó csúcs alapja, annál jobban fognak működni az előtelítési vagy keskeny sávú szelektív jelelnyomási technikák. Szerencsére a mező-leképezési technikák és a gradiens shimming megjelenése leegyszerűsítette ezt a gyakran időigényes feladatot, azaz a shimbeállítások minden egyes mintára történő beállítását. Lesznek azonban olyan minták, amelyek esetében a shim-térképek nem működnek jól, és az optimális műszerre adott válasz eléréséhez időt kell fordítani a shim beállítására.
A spektrométer érzékenységének standard mintákkal történő értékelése ideális módja a rendszer teljesítményének nyomon követésére, és a standard tesztekből kapott értékeknek meg kell felelniük a gyártó által meghatározott spektrométer-specifikációknak vagy meg kell haladniuk azokat. Megjegyzendő, hogy a spektrométer specifikációit a gyártó gyakran konzervatív módon határozza meg, hogy biztosítsa, hogy a műszer a telepítéskor átmegy ezeken a teszteken. Az OQ/PQ tesztek rendszeres időközönkénti lefuttatása azonban lehetővé teszi a spektrométer tulajdonosának, hogy megismerje az adott műszer képességeit. A rutinszerű teszteléssel megállapított értékkészlettől való eltéréseket gondosan meg kell vizsgálni, mivel ezek a műszer hibás működésére utalhatnak.
A szerves oldószerekben végzett kismolekulaelemzések esetében a deuterált kloroformban lévő acetonjel használata, hogy ne csak Lorentziánus vonalformát és keskeny FWHH-t, hanem keskeny bázist (pl. <20 Hz a 13C-szatellitjel 20%-ánál) érjenek el, általában a legjobb érzékenységet eredményezi a deuterált kloroformban lévő etilbenzoljeleken. A vizes oldatokban spektrumok felvételére használt spektrométerek esetében egy második érzékenységmérés fontosabb: a spektrométer azon képessége, hogy a vízcsúcs közelében lévő jelekből jó érzékenységet és felbontást érjen el. Így a 95% H2O/5% D2O oldatban lévő 2 mM szacharózból álló, vízszuppresszió alkalmazásával készült standardból származó anomer protonjelekkel végzett érzékenységmérés reálisabb mérőszáma a spektrométer jel-zaj viszonyának a fehérje terápiás minták NMR vizsgálatához.
A fehérje terápiás minták minőségét értékelő spektrométeren végzett PQ esetében e gyógyszerek kritikus minőségi jellemzője az aminosav lánc hajtogatása által kölcsönzött specifikus tercier szerkezet. Ezért a 2D-szerkezeti térképelemzést végző spektrométeren végzett PQ-ként a 2D-HSQC spektrumok rövid idő alatt lefuttathatók 15N vagy 13C izotóppal dúsított mintán, hogy megállapítsák a spektrométer képességét a hatékony szétkapcsolási sémákkal és gradiens koherencia-választással végzett impulzusprogramok végrehajtására. A kereskedelemben 13C vagy 15N izotóppal dúsított fehérje (pl. SH3-domén fehérje vagy ubikvitin) standard oldatok zárt csövekben kaphatók olyan koncentrációban, amelyek lehetővé teszik az adatok néhány óra alatt történő gyűjtését. Megfelelően kalibrált, 500 MHz-es vagy annál magasabb frekvencián működő és krioszondával felszerelt spektrométerekkel természetes abundanciájú (azaz izotópokkal nem dúsított) fehérjék 2D-szerkezeti térképeit lehet mérni ∼1,0 mM koncentrációban, 2-3 nap spektrométeridő alatt .
.