Illumina festékszekvenálás
Genomic LibraryEdit
A DNS tisztítása után DNS-könyvtárat, genomi könyvtárat kell létrehozni. A genomi könyvtárat kétféleképpen lehet létrehozni, szonifikációval és tagmentációval. A tagmentálással a transzpozázok véletlenszerűen 50 és 500 bp közötti méretű fragmentumokra vágják a DNS-t, és ezzel egyidejűleg adaptorokat adnak hozzá. Genomikus könyvtárat lehet létrehozni a genomi DNS szonifikációval történő fragmentálásával is. A szonifikáció a DNS-t ultrahangos hanghullámok segítségével hasonló méretűre fragmentálja. A jobb és bal oldali adaptereket a szonifikáció után T7 DNS-polimerázzal és T4 DNS-ligázzal kell csatolni. Azokat a szálakat, amelyeknél az adapterek nem ligálódnak, kimossák.
AdaptersEdit
Az adapterek három különböző szegmenst tartalmaznak: a szilárd hordozóhoz komplementer szekvenciát (oligonukleotidok az áramlási cellán), a vonalkódszekvenciát (indexek) és a szekvenáló primer kötőhelyét. Az indexek általában hat bázispár hosszúak, és a DNS-szekvenciaelemzés során a minták azonosítására szolgálnak. Az indexek lehetővé teszik akár 96 különböző minta együttes lefuttatását, ezt nevezik multiplexelésnek is. Az elemzés során a számítógép az azonos indexű leolvasásokat csoportosítja. Az Illumina a “szekvencia szintézis szerinti” megközelítést alkalmazza. Ez a folyamat egy akrilamiddal bevont üveg áramlási cellában zajlik. Az áramlási cella alját oligonukleotidok (rövid nukleotidszekvenciák) borítják, amelyek szilárd hordozóként szolgálnak a DNS-szálak helyben tartásához a szekvenálás során. Ahogy a fragmentált DNS-t átmossák az áramlási cellán, a megfelelő adapter a komplementer szilárd hordozóhoz kapcsolódik.
Híd amplifikációSzerkesztés
Amint csatlakoztak, kezdődhet a fürtgenerálás. A cél több száz azonos DNS-szál létrehozása. Néhány lesz az előremenő szál; a többi a fordított szál. Ezért használunk jobb és bal oldali adaptereket. A klasztereket híd-amplifikációval hozzuk létre. A DNS-polimeráz végighalad egy DNS-szálon, létrehozva annak komplementer szálát. Az eredeti szál kimosódik, és csak a fordított szál marad meg. A fordított szál tetején egy adapterszekvencia található. A DNS-szál meghajlik, és a felső adapterszekvenciához komplementer oligóhoz kapcsolódik. A polimerázok a fordított szálhoz kapcsolódnak, és létrejön a komplementer szál (amely azonos az eredetivel). Az immár kettős szálú DNS-t denaturáljuk, hogy mindkét szál külön-külön kapcsolódhasson az áramlási cellához rögzített oligonukleotid szekvenciához. Az egyik lesz a fordított szál; a másik az előremenő. Ezt a folyamatot híd-amplifikációnak nevezzük, és egyszerre több ezer klaszteren történik az áramlási cella egészén.
Klonális amplifikációSzerkesztés
A DNS-szálak újra és újra meghajlanak, és a szilárd hordozóhoz kapcsolódnak. A DNS-polimeráz szintetizál egy új szálat, hogy egy kétszálú szegmenst hozzon létre, és ez denaturálódik, így az egy területen lévő összes DNS-szál egyetlen forrásból származik (klonális amplifikáció). A klonális amplifikáció a minőségellenőrzés szempontjából fontos. Ha egy szálon furcsa szekvenciát találnak, akkor a tudósok ellenőrizhetik a fordított szálat, hogy megbizonyosodjanak arról, hogy az ugyanannak a furcsaságnak a komplementerét tartalmazza. Az elülső és a hátsó szálak ellenőrzésként szolgálnak a műhibák ellen. Mivel az Illumina szekvenálás DNS-polimerázt használ, bázishelyettesítési hibákat figyeltek meg, különösen a 3′ végén. A párosított végű leolvasások klasztergenerálással kombinálva megerősíthetik, hogy hiba történt. A reverz és forward szálaknak komplementereknek kell lenniük egymáshoz, minden reverz leolvasásnak meg kell egyeznie egymással, és minden forward leolvasásnak meg kell egyeznie egymással. Ha egy olvasat nem eléggé hasonlít a társaihoz (amelyekkel klónnak kellene lennie), akkor hiba történhetett. Egyes laboratóriumok elemzései során 97%-os minimális hasonlósági küszöbértéket alkalmaztak.
Szekvencia szintézisselSzerkesztés
A klón amplifikáció végén az összes reverz szál kimosódik az áramlási cellából, és csak az előremenő szálak maradnak. Egy primer csatlakozik az előremenő szálak adapterprimer-kötőhelyéhez, és egy polimeráz fluoreszcensen jelölt dNTP-t ad a DNS-szálhoz. Körönként csak egy bázist lehet hozzáadni, mivel a fluorofór blokkoló csoportként működik; a blokkoló csoport azonban reverzibilis. A négyszínű kémia alkalmazásával a négy bázis mindegyike egyedi emisszióval rendelkezik, és minden kör után a gép rögzíti, hogy melyik bázist adták hozzá. A szín rögzítése után a fluorofort kimossuk, majd egy másik dNTP-t átmossuk az áramlási cellán, és a folyamatot megismételjük. A dATP-ket, dTTP-ket, dGTP-ket és dCTP-ket külön-külön mossuk át a cellán, így minden egyes nukleotid azonosítható.
A NextSeq, majd később a MiniSeq bevezetésével az Illumina új, kétszínű szekvenálási kémiát vezetett be. A nukleotidok megkülönböztethetők a két szín egyikével (piros vagy zöld), szín nélkül (“fekete”) vagy a két szín kombinálásával (a piros és a zöld keverékeként narancssárgának tűnnek).
A DNS-szál leolvasása után az éppen hozzáadott szálat kimossák. Ezután az index 1-es primer csatlakozik, polimerizálja az index 1-es szekvenciát, majd lemossuk. A szál ismét hidat képez, és a DNS-szál 3′ vége az áramlási cellán lévő oligóhoz kapcsolódik. Az index 2 primer csatlakozik, polimerizálja a szekvenciát, és kimossuk.
A polimeráz szekvenálja a komplementer szálat az íves szál tetején. Ezek szétválnak, és mindkét szál 3′ vége blokkolódik. Az elülső szálat kimossuk, és a szekvencia-szintézis folyamata megismétlődik a fordított szál esetében.
AdatelemzésSzerkesztés
A szekvenálás egyszerre több millió klaszterre történik, és minden klaszterben ~1 000 azonos DNS-inzert másolat található. A szekvenciaadatokat úgy elemezzük, hogy megkeressük az átfedő területű fragmentumokat, az úgynevezett contigeket, és felsorakoztatjuk őket. Ha ismert egy referenciaszekvencia, akkor a contigeket azzal hasonlítják össze a variánsok azonosításához.
Ez a darabos eljárás lehetővé teszi a tudósok számára, hogy lássák a teljes szekvenciát, még akkor is, ha egy töredezetlen szekvenciát soha nem futtattak le; mivel azonban az Illumina olvasási hossza nem túl hosszú (a HiSeq szekvenálás 90 bp körüli olvasási hosszúságot tud produkálni), a rövid tandemismétlődő területek feloldása nehézséget jelenthet. Továbbá, ha a szekvencia de novo, és nem létezik referencia, az ismétlődő területek sok nehézséget okozhatnak a szekvencia összerakásában. További nehézségek közé tartoznak a pontatlan polimerázok által okozott báziscserék (különösen a leolvasások 3′ végén), a kiméra szekvenciák és a PCR-bias, amelyek mind hozzájárulhatnak a hibás szekvencia létrehozásához.