The genetic variation of different developmental stages of Schistosoma japonicum : do the distribution in snails and pairing preference benefit the transmission?
Sample collection
Sample collection and experimental design are summarised in Fig. 1. Az alábbiakban a mintagyűjtés lépéseit ismertetjük, beleértve a csigagyűjtést, a cercáriák gyűjtését, az egérfertőzés és a kifejlett féreg gyűjtését, valamint a miracídiumok gyűjtését.
Mintagyűjtés és kísérleti terv folyamatábrája
Siklócsigák gyűjtése
A Dongting-tó keleti területéről (29° 32′ 5.25″ É, 112° 52′ 35.00″ K), Hunan tartomány, Kína. A csigákat 3 falu 10 km távolságban lévő árkaiban találtuk. A gyűjtés helye mocsár, nem nemzeti park vagy más védett terület, illetve magánterület. A gyűjtést a területen a csigák elleni védekezést felügyelő Hunan tartomány (Kína) Schistosomiasis Elleni Intézetének engedélyével és segítségével végezték. Az Oncomelania hupensis nem veszélyeztetett vagy védett faj. A csigákat visszavitték a laboratóriumba, és a márciusban gyűjtött csigákat az A csoportba, a szeptemberben gyűjtött csigákat pedig a B csoportba sorolták. Egy hónapos fogság után a csigákat megmosták, és 25 °C-on 3 órán át vízzel töltött egyedi üvegekbe helyezték át fényben, hogy a S. japonicum-fertőzés azonosításához szükséges cercáriák megjelenését serkentsék. Végül az A csoportból 20 csigát és a B csoportból 25 csigát S. japonicummal fertőzöttként azonosítottak.
Cerkáriagyűjtés
Az egyes csigákból kiszabadult cerkáriák egy részét hurok segítségével egy tálba helyeztük, és mikroszkópos vizsgálat alatt cerkáriamosó oldatban (5 g/l laktalbumin-hidrolizátum, 6,8 g/l NaCl, 0,4 g/l KCL, 0,2 g/l CaCl2, 0,2 g/l MgSO4-7H2O és 1 g/l glükóz) mostuk. Három mosás után a cercariákat egyenként 2 μl sterilizált mosóoldattal pipettáztuk egy Whatman™ FTA kártyára (GE Healthcare, Pittsburgh, USA). Szárítás után a kártyákat lezárt műanyag zacskóban, exszikkátorban, szobahőmérsékleten tároltuk. Csigánként legalább 50 cercáriát gyűjtöttünk egyenként és tároltunk Whatman™ FTA kártyákon.
Egerek fertőzése egyedi csigából származó cercáriákkal
A S. japonicummal fertőzött egyivarú csigák megkülönböztetéséhez 2 laboratóriumi Kunming egeret perkután fertőztünk meg minden csigából származó 30 cercáriával egérenként. Összesen 40 egeret fertőztünk meg az A csoport 20 csigájára, és 50 egeret a B csoport 25 csigájára. 7 héttel a fertőzést követően 0,9%-os NaCl-mal történő perfúzióval és boncolással nyertük ki a férgeket az egyes egerek mesenterialis vénáiból. Gondoskodtunk arról, hogy a perfúzió és a boncolás során a lehető legkisebbre csökkentsük a mechanikai erő okozta páros felnőtt férgek felhasadásának lehetőségét, 3 tapasztalt technikus segítségével a lehető leggyorsabban dolgoztuk fel a férgeket. Minden gilisztapárt azonnal külön csövekbe helyeztünk át mosás és jelölés céljából, majd páronként abszolút etanolban tároltuk, miután spontán szétváltak. Az egyes egerekből származó páratlan férgeket mikroszkóposan ellenőriztük a nem megerősítése céljából, majd etanolban tároltuk.
Egerek fertőzése az összes csigából összevont cercáriákkal (I. és II. módszer) és felnőtt férgek gyűjtése
A későbbi fertőzésekhez az A csoport 20 csigájából 17, a B csoport 25 csigájából 16 maradt életben és képes volt elegendő cercáriát termelni. A csigák két csoportja esetében két különböző cercaria-gyűjtési módszert alkalmaztunk. Az A csoport 17 megmaradt csigája esetében az összes csigát egy vizet tartalmazó lombikban összevonták, hogy serkentsék a cerkáriák kifejlődését (I. módszer). Ezután harmincegy egeret perkután fertőztünk meg egérenként 34 cercáriával. A B csoport 16 csigáját használó fertőzéshez az egyes csigákból külön-külön kikerülő 2 cercáriát összevonták, és a kevert 32 cercáriát egy egér megfertőzésére használták (II. módszer), összesen 22 egér megfertőzésére replikálva. Valamennyi egeret feláldozták a S. japonicum férgek begyűjtéséhez 7 héttel a fertőzés után a fent leírtak szerint. Végül 530 férget gyűjtöttünk az I. módszerrel (A csoport), 484 férget a II. módszerrel (B csoport) fertőzött egerekből.
Miracidiumgyűjtés
Mielőtt minden fertőzött egeret feláldoztunk volna a kifejlett férgek gyűjtése céljából, minden egér székletét 7 napig gyűjtöttük, hogy a miracidiumok kikeléséhez a beleken keresztül ürített petéket koncentráljuk. Az egyes egerekből származó petesejtek üledékét 25 °C-on, fényben tartott lombikban klórmentesített víznek tettük ki a miracídiumok kikelése érdekében. A miracídiumokat az egyes lombikok felső vizéből pipettával szedtük ki, és egy miracídiummosó oldatot (5 g/l laktalbumin-hidrolizátum, 6,5 g/l NaCl, 0,14 g/l KCl, 0,12 g/l CaCl2 és 0,20 g/l NaHCO3) tartalmazó tálba helyeztük át. Három mosás után a miracídiumokat egyenként 2 μl sterilizált mosóoldattal pipettáztuk egy Whatman™ FTA kártyára. Szárítás után a kártyát lezárt műanyag zacskóban, exszikkátorban, szobahőmérsékleten tároltuk. Egér székletenként legalább 50 miracídiumot gyűjtöttünk.
A fertőzött egerek májában csapdába ejtett petékből kikelt miracídiumokat szintén az alábbiak szerint gyűjtöttük. Minden egyes fertőzött egér máját a kifejlett féreg begyűjtése után összegyűjtöttük, hideg 1,2%-os NaCl-ban homogenizáltuk, és a peteüledék kinyerése érdekében megszűrtük. A miracídiumokat a székletmintával azonos módszerrel keltették ki. Végül egérmájanként legalább 50 miracídiumot egyenként pipettáztunk és Whatman™ FTA kártyákra tároltunk.
Genomi DNS extrakció
Az egyes cercaria vagy miracidium minták DNS-éhez egy 2 mm átmérőjű Harris Micro-punch (GE Healthcare Life Sciences, Stevenage, UK) segítségével a Whatman™ FTA kártya minden egyes minta pipettázási területének közepéről egy 2 mm-es korongot távolítottunk el. A korongot egy 96 lyukú, 1,2 ml-es U-fenekű lemez aljába helyeztük. Miután 5 percig 100 μl FTA tisztító reagenssel (GE Healthcare Life Sciences), majd 100 μl TE pufferrel (10 mM Tris-Cl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0) mosottunk, 14 µl 0,1 M NaOH 0,3 mM EDTA-val, pH 13,0-t adtunk minden lyukba, és az oldatot 5 percig inkubáltuk, majd 26 µl 0,1 M Tris-HCl puffert, pH 7,0-t adtunk hozzá. Ezután a lemezt vortexkeverővel 3 alkalommal, egyenként kb. 10 másodpercig tartó pulzálással összekevertük. Ezután az oldatot 10 percig szobahőmérsékleten hagytuk, 10 alkalommal pulzáló vortexeltük, majd az eluátumot tiszta 96 lyukú lemezbe vittük át, és további felhasználásig – 20 °C-on tároltuk.
Az egyes kifejlett férgek esetében az elülső részt, beleértve a méhet is, mikroszkóp alatt levágtuk minden egyes kifejlett nőstény féregről, hogy elkerüljük a méhben lévő peték hatását a nőstény féreg genotípusára. Míg az egész hím vagy éretlen nőstény férgeket használtuk a DNS kivonásához. A teljes genomi DNS-t minden egyes féregből külön-külön extraháltuk standard nátrium-dodecil-szulfát-proteináz K eljárással az alábbiak szerint. Minden egyes férget 400 μl extrakciós pufferben, amely 50 mM Tris-HCl-t, 50 mM EDTA-t, 100 mM NaCl-t, 1% SDS-t és 100 mg/ml proteináz K-t tartalmazott, 56 °C-on inkubáltunk és felolvasztottunk 1 órán keresztül, óvatos keverés mellett. Az oldatban lévő DNS-t standard fenol/kloroformos tisztítással extraháltuk, majd 3 M nátrium-acetát (pH 5,2) és etanolos kicsapás következett. A DNS-pelleteket 70%-os etanollal mostuk, levegőn szárítottuk, majd 20 μl TE-ben (pH 8,0) reszuszpendáltuk, és – 20 °C-on tároltuk a felnőtt féreg nyers DNS-kivonataként a további felhasználásig.
PCR-amplifikáció és mikroszatellita genotipizálás
Az FTA-kártya elúciójában vagy az etanolban tárolt minta nyers kivonatában lévő genomiális DNS meglétének igazolására a 28S riboszomális DNS génfragmentumot egyetlen cercaria, miracidium vagy kifejlett féreg DNS-oldatából amplifikáltuk a következő primerek használatával: (5′-GTG GAG TTG AAC TGC AAG C-3′) és fordított (5′-GCT CAA CAW TAA TAG TCA AAC CTG-3′). A PCR-eket az Illustra PuReTaq Ready-To-Go PCR-gyöngyökkel végeztük 96 lyukú lemezben (GE Healthcare Life Sciences, USA). Minden egyes gyöngyhöz 2 µl FTA elúciót adtunk egyetlen lárvából vagy 0,5 µl nyers kivonatot egyetlen féregből, 1 µl-t az egyes primerekből és vizet, hogy a végső térfogat 25 µl legyen. Az amplifikációt a következő programmal hajtottuk végre: 95 °C-on 5 percig; majd 40 ciklus, 30 másodperc 95 °C-on, 30 másodperc 60 °C-on és 40 másodperc 72 °C-on; és egy utolsó hosszabbítási lépés 72 °C-on 7 percig. A reakciókat ezután 5 µl 2%-os agaróz TAE gélen történő futtatásával ellenőriztük.
Kisléptékű genotipizálást végeztünk 30 cercaria, 30 miracídium és 30 féreg esetében, amelyeket véletlenszerűen választottunk ki, hogy optimális multiplex mikroszatellita lokusz panelt építsünk a PCR-amplifikációhoz. Húsz, korábbi tanulmányokban és laboratóriumunkban kifejlesztett és validált lókuszt ellenőriztünk. Végül 9 mikroszatellita lókuszt (Additional file 1: S1 táblázat) választottunk ki a panel kialakításához. Az egyes DNS-minták mikroszatellita lókuszainak genotipizálása a Type-it Microsatellite PCR kit (Qiagen, Manchester, Egyesült Királyság) segítségével történt, a 9 lókusz multiplexével. Az egyes párok forward primerét megfelelő fluoreszcens festékkel jelöltük, beleértve a 6-FAM, HEX, TAMRA és ROX festékeket (Additional file 1: S1 táblázat). A PCR-reakciókat 96 lyukú PCR-lemezben készítettük 6,25 μl 2× master mix, 1,25 μl Q oldat, 0,5 μl primerek (10 μM), 2 μl DNS-templát és 2,5 μl ddH2O felhasználásával, majd Bio-Rad termociklálóban hajtottuk végre a következő programmal: 95 °C-on 5 percig; majd 35 ciklus, 30 s 95 °C-on, 90 s 60 °C-on és 3 perc 72 °C-on; majd egy utolsó hosszabbítási lépés 60 °C-on 45 percig. A PCR-reakciókat 5 µl 2%-os TAE agaróz gélen történő futtatásával ellenőriztük, és a sikeres amplifikációkat elküldtük a Sangon Biotech-nek (Sanghaj, Kína) ABI3100 genetikai analizátoron (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) történő fragmentelemzésre. A genotípusok pontozása a Geneious 11.0 mikroszatellit plugin segítségével történt. Minden mintát kétszer amplifikáltunk és genotipizáltunk az eltérés csökkentése érdekében. Összesen 346 cercaria, 701 kifejlett féreg és 393 miracídium genotípusát állítottuk elő a következő elemzésekhez.
Genetikai diverzitás elemzések
Az egyes lókuszok genetikai diverzitását az összes genotipizált cercaria esetében az allélek megfigyelt számának (Na), az allélek effektív számának (Ae) GenAlEx 6.5-ben történő kiszámításával, valamint az allélgazdagság (Ar) és a géndiverzitás (Hs) hierfstat ver. 0.04-22 , beleértve az A csoport 20 csigájából származó 156 cercáriát és a B csoport 25 csigájából származó 190 cercáriát. A Hardy-Weinberg-egyensúlytól (HWE) való eltérést az egyes lókuszok esetében a GenAlExben a Chi-négyzet teszttel teszteltük, és a lókuszok közötti kapcsolategyenlőtlenségi tesztet az SHEsisben számoltuk ki .
A Na, Ae, Ar és Hs értékeket a különböző populációkra az egérfertőzés során az alábbiak szerint számoltuk ki. A fertőzés során használt cerkáriapopulációk esetében az A csoport 17 csigájából származó 132 cerkáriát (az I. módszerben használták) és a B csoport 16 csigájából származó 122 cerkáriát (a II. módszerben használták) értékelték. A genotipizálás és a gyenge minőségű adatok szűrése után a felnőtt férgek legalább 5 párját (ha voltak) és az egyes egerekből származó összes nem párosított férget sikeresen genotipizálták. Összesen 357 egérből származó férget vontak be az I. módszerben (az A csoport 17 egyesített csigájából származó cercariák felhasználásával), 344 egerekből származó férget a II. módszerben (a B csoport 16 egyedi csigájából származó, egyenlően kevert cercariák felhasználásával). Ezenkívül az egyes egerekben lévő kifejlett férgek genetikai diverzitását is megbecsültük, hogy külön-külön ellenőrizzük a kifejlett férgek allélkonzisztenciáját az I. és II. módszerben szereplő egerek között. A miracidium-populációk esetében a májból és székletből származó miracidiumok genetikai diverzitását populáción felüli szinten számoltuk ki (az összes egér májából vagy székletéből származó miracidiumok), mivel minden egérben csak 3-4 májból vagy székletből származó miracidiumot genotipizáltunk, beleértve 93 májból származó miracidiumot (egérenként 3) és 124 székletből származó miracidiumot (egérenként 4) az I. módszerben, és 88 májból és székletből származó miracidiumot (egérenként 4) a II. módszerben.
Molekuláris varianciaelemzés (AMOVA)
Az A és B csoportból származó összes genotipizált cercaria genetikai differenciáltságát az Arlequin ver. 3.5.2.2 . Az egérfertőzéshez nem használt csigák kizárása után az A csoport 17 csigájából származó 132 cercaria (az I. módszer esetében) és a B csoport 16 csigájából származó 122 cercaria (a II. módszer esetében) közötti különbséget vizsgáltuk. A fertőzést követően az I. módszer 357 kifejlett férge és az eredeti cerkáriapopuláció (132 cerkária az A csoportból) közötti különbségtételt vizsgáltuk. Szintén teszteltük a II. módszer 344 férgét a B csoportból származó 122 cercáriával szemben. Ezenkívül külön értékeltük a felnőtt férgek eltérését 31 egér között az I. módszerben és 22 egér között a II. módszerben. A miracidiumok esetében a genetikai különbséget az I. módszerben a májból származó 93 miracidium és a székletből származó 124 miracidium között vizsgálták, és ugyanezt tették a II. módszerben a májból és a székletből származó 88 miracidium esetében is.
A niMLG-vel rendelkező cerkáriák szingletonjainak rokonsági elemzése
Az egyes csigákból származó cerkáriák genotípusainak számát számolták. Mivel nehéz megkülönböztetni a tipizálási hibákat vagy a sporociszta-szaporodás során bekövetkező szomatikus mutációt az eredeti miracidium genotípustól, a 2-nél kevesebb eltérést mutató alléllal rendelkező cercaria genotípusok egy csoportját niMLG-ként azonosítottuk, és minden egyes csigában ugyanabból a miracidiumból származó vonalhoz rendeltük. Végül az egyes csigákban genetikai klónokat létrehozó miracidiumok számát a vonalszám alapján az R csomag allelematch ver segítségével értékeltük. 2.5 .
Mivel az egy csigában niMLG-vel rendelkező cercariákról feltételezték, hogy egy miracidiumtól származnak , a niMLG-ek egyik genotípusát (singleton) az allelematch amCluster funkciójával a miracidiumok közötti rokonsági elemzéshez szükséges szűrt adathalmaz előállítása érdekében egy olyan cercariacsoportot jelöltek ki, amely egy miracidiumból származik. Ezután a szingletonok (miracídiumok) közötti rokonságot a SPAGeDi ver-ben a Streiff szerinti allélméret korrelációs együttható (I′) segítségével becsültük meg. 1.5a csigán belüli és csigák közötti szinten az A csoportba tartozó 20 csiga és a B csoportba tartozó 25 csiga esetében, hogy kiderüljön, hogy a miracídiumok egy csigán belüli aggregációja korrelál-e a miracídiumok genetikai hasonlóságával.
A különböző számú csigából származó cercaria-alcsoportok alléleloszlása
A cercariák nem egyenletes genetikai eloszlása a csigák között arra utal, hogy a csiga-gazdák mintanagysága befolyásolná a cercaria-szuprapopuláció (az összes csigából származó cercariák) alléleloszlását. A Na-t, a populáció génbőségét jelző alapvető mutatót, a továbbiakban minden egyes lokuszra vonatkozóan különböző számú csiga véletlenszerű kiválasztásával értékeltük a különböző cercaria-alcsoportokban. A csigákat véletlenszerűen választottuk ki minden adott csigaszámnál, amelyet minden csoportban 1-től a maximumig állítottunk be az R-ben található sample alapfüggvény segítségével, 100 ismétléssel. Minden ismétlés alatt az egyes csigákban lévő cercáriák számát 5-re állítottuk be, amelyet a gyakorlati megvalósíthatóság és az ebben a vizsgálatban az egyes csigákban genotipizált cercáriák átlagos száma alapján határoztunk meg. Az azonos számú csigához tartozó cercariák genotípusait összevontuk, majd a Na-t minden egyes lokuszra a hierfstat R-csomagban található nb.alleles függvénnyel becsültük. A genetikai diverzitás és a csigaszám közötti viszonylagosságot a csigák legkisebb mintanagyságának kiszámításával értékeltük, amikor a teljes Na 50%-át és 95%-át határoztuk meg.
Genetikai távolság a nőstény és hím felnőtt férgek között
A S. japonicum lehetséges genetikai preferenciájának kimutatására a párzás során a Populations ver segítségével mértük az egyes párok hím és nőstény egyedei közötti Dsw egyedközi genetikai távolságot. 1.3.32 (http://www.bioinformatics.org/~tryphon/populations/), és összehasonlítottuk a párosított nőstény és a nem párosított férgek (ha rendelkezésre áll, a nem párosított férgek többnyire hímek) közötti távolsággal ugyanabban a gazdaszervezetben.
A miracídiumok apaságának azonosítása
Az egyes egerek összes felnőtt férgének és miracídiumának allélfrekvenciáját elemeztük és kiszámítottuk a Cervus 3.0 Allele Frequency Analysis funkciójával. Végül mind a 9 lokuszt alkalmas markernek ítéltük a további származáselemzésre, mivel az összesített kizárási valószínűségük kisebb volt, mint 0,01%. Az allélfrekvencia alapján a Származáselemzés szimulációja funkciót alkalmaztuk a kodomináns lókuszok felbontóképességének és a log-lelihood (LOD) kritikus értékeinek becslésére a következő feltételezésekkel: 10 000 utód (miracídium) minden egyes egér esetében; 10 jelölt anya és apa minden egyes egérben (a minta becsült mérete az egy gazdában gyűjtött kifejlett férgek száma alapján); a jelöltek arányát a genotipizált kifejlett férgek 100%-ára állítottuk; a többi opciót alapértelmezetten állítottuk be. Végül az Allélgyakoriság-elemzés és a Származáselemzés szimulációja kimeneteire a Származáselemzés modulban hivatkoztunk, hogy az egyes utódokat a legvalószínűbb szülőkhöz rendeljük. Az utódokkal több mint 2 allél eltérést mutató szülőket kizártuk, és azokat a szülőket tekintettük a legvalószínűbb szülőknek, amelyek a legnagyobb LOD-értékkel rendelkeztek.
Statisztikai elemzés
A jelen tanulmányban a statisztikai elemzésben használt összes adat folyamatos adat. A lókuszok genetikai diverzitási indexeinek (Na, Ae, Ar és Hs), a rokonsági együtthatónak (I′) és az egyedek közötti genetikai távolságnak (Dsw) a két csoport közötti különbség szignifikanciáját 0,05-ös szignifikanciaszinten értékeltük. Először az adatsorok normális eloszlását a Sharpiro-Wilk-teszttel ellenőriztük. Ha az adatsorok megfeleltek a normális eloszlásnak, akkor páros mintás/független t-próbát alkalmaztunk. Ellenkező esetben a Wilcoxon aláírt rangsor tesztet és a Mann-Whitney U-tesztet alkalmazták a kapcsolódó/független mintákra. Bonferroni korrekciót alkalmaztunk a P-érték korrekciójára többszörös összehasonlítás esetén.