The genetic variation of different developmental stages of Schistosoma japonicum: do the distribution in snails and pairing preference benefit the transmission?
Sample collection
Sample collection and experimental design summary in Fig.1. 試料採取の手順は、カタツムリの採取、幼虫の採取、マウスの感染と成虫の採取、ミラクシディアの採取など、以下に概説する
サンプル収集と実験デザインのフローチャート
カタツムリの収集
Oncomelania hupensisカタツムリは2016年3月と9月にDongting湖東エリア（29° 32′ 5.25″ N, 112° 52′ 35.00″ E)、中国湖南省から採取した。 カタツムリは10km離れた3つの村の側溝に生息していた。 採集地は湿地帯であり、国立公園などの保護区や私有地ではない。 採集は、この地域のカタツムリ防除を監督する中国湖南省住血吸虫症対策研究所の許可と協力のもとに行われた。 Oncomelania hupensisは絶滅危惧種や保護種ではない。 カタツムリは実験室に持ち帰られ、3月に採取したものはグループA、9月に採取したものはグループBに分類された。 1ヶ月間の飼育後，S. japonicum感染を確認するための幼虫の出現を促すため，カタツムリを洗浄し，水を張った個々のバイアルに移し，25℃の光下で3時間静置した． 最終的に，グループAから20匹，グループBから25匹のカタツムリがS. japonicumに感染していると同定された．
保菌者採取
個々のカタツムリから保菌者を放出した後、一部をループを使って皿に移し、顕微鏡下で保菌者洗浄液（5 g/l ラクトアルブミン加水分解物、6.8 g/l NaCl、0.4 g/l KCL、0.2 g/l CaCl2、0.2 g/l MgSO4-7H2O および 1 g/l グルコース） で洗浄した。 3回洗浄後、Whatman™ FTAカード (GE Healthcare, Pittsburgh, USA) に2μlの滅菌洗浄液を加えて個体ずつピペッティングし、細胞虫を得た。 乾燥後、カードは密閉したビニール袋に入れ、室温のデシケーターで保存した。
Mice infection with cercariae from individual snail
S. japonicum infected snailsの雌雄を識別するために，2匹のKunmingマウスに各マウスから30匹のcercariaeを経皮的に感染させた． 感染後7週間後に0.9％NaClによる灌流と解剖を行い，各マウスの腸間膜静脈から虫を回収し，A群20匹に対して40匹のマウス，B群25匹に対して50匹のマウスを感染させた． 灌流・解剖時の機械的な力による対になった成虫の分裂の可能性を最小限にするため、3名の経験豊富な技術者を用いて、できるだけ迅速に処理するように注意した。 各対の虫は、直ちに洗浄とマーキングのために別々のチューブに移され、自然に分離した後は対になって絶対エタノール中で保存された。 各マウスの対になっていない虫は、顕微鏡で性別を確認した後、エタノールで保存した。
すべてのカタツムリからプールした幼虫によるマウス感染（方法IおよびII）と成虫収集
その後の感染では、グループAの20匹中17匹、グループBの25匹中16匹が生存し、十分にカタツムリを作ることができる状態であった。 2つのグループのカタツムリに対して2つの異なる保菌方法を使用した。 グループAの残りの17匹のカタツムリについては、すべてのカタツムリを水を含むフラスコにプールして、幼虫の出現を刺激した（方法I）。 その後、31匹のマウスを経皮的に感染させ、1匹につき34匹のイエカリアを感染させた。 B群の16匹のカタツムリを用いた感染では、個々に脱皮したカタツムリから2匹のセルカリアをプールし、混合した32匹のセルカリアを用いてマウスに感染させ（方法II）、複製して合計22匹のマウスに感染させた。 全てのマウスを犠牲にして、上記と同様に感染後7週間のS. japonicum虫を採取した。 最終的に、方法Iによるマウスから530匹（グループA）、方法IIによるマウスから484匹（グループB）を集めた。
ミラシディアの収集
すべての感染マウスを犠牲にして成虫を収集する前に、各マウスの便を7日間集め、腸から排泄される卵を濃縮してミラシディアを羽化させた。 各マウスの卵沈殿物をフラスコ内で脱塩素水に暴露し、25℃、照明下でミラクルイカを孵化させた。 各フラスコの上水からピペットでミラクシディアを採取し、ミラクシディア洗浄液（5 g/l ラクトアルブミン加水分解物、6.5 g/l NaCl、0.14 g/l KCl、0.12 g/l CaCl2、および 0.20 g/l NaHCO3）の入った皿に移し替えた。 3回洗浄後、Whatman™ FTAカードに2μlの滅菌した洗浄液でミラクシディアを個々にピペッティングした。 乾燥後、カードは密閉したビニール袋に入れ、室温のデシケーターで保存した。 また、感染したマウスの肝臓に捕獲された卵から孵化したミラクシディアを以下のように収集した。 各感染マウスの肝臓を成虫回収後、冷1.2%NaClでホモジナイズし、濾過して卵沈渣を得た。 便サンプルの場合と同様の方法でミラクシディアを孵化させた。
Genomic DNA extraction
1個のセルカリアまたはミラシディウムサンプルのDNAは、2mm Harris Micro-punch (GE Healthcare Life Sciences, Stevenage, UK) を用いて、Whatman™ FTAカードの各サンプルピペットエリアの中心から直径2mmのディスクを取り出した。 このディスクを96ウェル、1.2 ml U底プレートの底部に設置した。 100 μl FTA 精製試薬 (GE Healthcare Life Sciences) で5分間洗浄した後、100 μl TE バッファー (10 mM Tris-Cl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0) を加え、14 μl 0.1 M NaOH with 0.3 mM EDTA, pH 13.0 の液を各ウェルに加え5分間インキュベートし、26 μl 0.1 M Tris-HCl buffer, pH 7.0 の液を加えた。 その後、ボルテックスミキサーで3回、それぞれ約10秒間、プレートを回転させながら混合した。 その後、室温で10分間放置し、パルスボルテックスを10回行い、溶出液を清潔な96ウェルプレートに移し、-20℃で保存し、さらに使用した。
個々の成虫については、子宮内の卵が雌の遺伝子型に影響するのを避けるために、それぞれの雌成虫から顕微鏡下で子宮を含む前部を切り落とした。 一方、DNA抽出には雄または未熟な雌の全虫を使用した。 全ゲノムDNAは、標準的なドデシル硫酸ナトリウム-プロテイナーゼKの手順を用いて、以下のように各ワームから個別に抽出した。 各ワームは、50 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1% SDS, 100 mg/ml proteinase Kを含む400 μl抽出バッファ中で56℃、1時間、穏やかに攪拌しながらインキュベーションし解凍させた。 溶液中のDNAを標準的なフェノール/クロロホルム精製で抽出し、3 M酢酸ナトリウム（pH 5.2）、エタノール沈殿を行った。 DNAのペレットを70%エタノールで洗浄し、風乾し、20μl TE (pH 8.0) に再懸濁し、成虫の粗DNA抽出物として-20℃で保存し、さらに使用した。
PCR増幅とマイクロサテライトジェノタイピング
FTAカード溶出液またはエタノール保存サンプルの粗抽出液にゲノムDNAが存在することを確認するために、以下のプライマーを用いて、セルカリア・ミラシジウム・成虫1匹のDNA溶液から28SリボソームDNA遺伝子断片を増幅させた。 forward (5′-GTG GAG TTG AAC TGC AAG C-3′) and reverse (5′-GCT CAA CAW TAA TAG TCA AAC CTG-3′). PCRは、Illustra PuReTaq Ready-To-Go PCR Beadsを96ウェルプレート（GE Healthcare Life Sciences, USA）にて実施した。 各ビーズに対して、単一幼虫からのFTA溶出液2μlまたは単一虫からの粗抽出液0.5μlを加え、各プライマー1μlと水を加えて最終容量を25μlとした。 増幅は、以下のプログラムで実施した。 95℃、5分；95℃、30秒、60℃、40秒を40サイクル；そして72℃、7分、最終伸長。
PCR増幅に最適なマルチプレックスマイクロサテライト遺伝子座パネルを構築するために、無作為に選んだ30匹のイエバエ、30匹のミラクシディア、30匹のワームについて小規模なジェノタイピングを実施した。 先行研究および当研究室で開発・検証された20の遺伝子座を確認した。 最終的に、9つのマイクロサテライト遺伝子座（Additional file 1: Table S1）を選択し、パネルとした。 各DNAサンプルのマイクロサテライト遺伝子座は、Type-it Microsatellite PCR kit (Qiagen, Manchester, UK) を用いて、9遺伝子座のマルチプレックスでジェノタイピングを行った。 各組のフォワードプライマーは、6-FAM、HEX、TAMRA、ROXを含む適切な蛍光色素で標識した（追加ファイル1：表S1）。 PCR反応は、2×マスターミックス6.25μl、Q溶液1.25μl、プライマー（10μM）0.5μl、DNAテンプレート2μl、ddH2O2.5μlを用いて96ウェルPCRプレートで調製し、Bio-Radサーモサイクラーで以下のプログラムで実施した。 95℃で5分間；95℃で30秒間、60℃で90秒間、72℃で3分間のサイクルを35回；その後、60℃で45分間最終伸長ステップを行った。 PCR反応は5 µlの2% TAEアガロースゲルで確認し、増幅に成功したものはSangon Biotech（中国、上海）に送り、ABI3100遺伝子解析装置（Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）で断片分析を行った。 遺伝子型は Geneious 11.0 のマイクロサテライトプラグインを使用してスコア化した。 すべてのサンプルは、偏差を減らすために2回増幅され、ジェノタイピングされた。
遺伝子多様性解析
各遺伝子座の遺伝子多様性は、GenAlEx 6.5で観察対立遺伝子数 (Na), 有効対立遺伝子数 (Ae), hierfstat ver.で対立遺伝子豊かさ (Ar) と遺伝子多様性 (Hs) を計算して、すべての遺伝子型付きのセルカリアの遺伝子型が作成されました。 0.04-22 で算出した。A群20匹、B群25匹のカタツムリから得た156匹のカタツムリを含み、各遺伝子座のHardy-Weinberg平衡（HWE）からの逸脱はGenAlExのカイ二乗検定で、遺伝子座間の連鎖不平衡検定はSHEsis .
マウス感染過程での異なる集団について以下のようにNa、Ae、ArおよびHsが算出された。 感染に用いたケラレ集団については、A群17匹（方法Iで使用）のケラレ132個とB群16匹（方法IIで使用）のケラレ122個を評価した。 遺伝子型を決定し、低品質データをフィルタリングした結果、各マウスから少なくとも5組の成虫（存在する場合）およびすべての未対応虫の遺伝子型決定に成功した。 合計で、方法I（グループAの17個のプールされたカタツムリから得た幼虫を使用）のマウスから357匹のワーム、方法II（グループBの16個の個々のカタツムリから均等に混合した幼虫を使用）のマウスから344匹のワームが関与していた。 さらに、方法IとIIで別々にマウス間の成虫の対立遺伝子の一致を確認するために、各マウスの成虫の遺伝的多様性を推定した。 なお、miracidium集団については、肝臓または便のmiracidiaを各マウス3-4匹のみ遺伝子型決定したため、超集団レベル（全マウスの肝臓または便のmiracidia）で遺伝子多様性を算出し、方法Iでは肝臓のmiracidia93匹（マウス3匹ずつ）、便のmiracidia124匹（マウス4匹）、方法IIでは肝臓と便の両方から88匹（別々にマウス4匹ずつ）を算出した。
分子分散分析（AMOVA）
グループAとグループBのすべての遺伝子型別セルカリアの遺伝的分化をArlequin ver.のAMOVAで推定した。 3.5.2.2 . マウス感染に使用しなかったカタツムリを除外し、グループA（方法I）の17匹のカタツムリから得た132匹のイエバエとグループB（方法II）の16匹のカタツムリから得た122匹のイエバエについて鑑別を行った。 感染後、方法Iの357匹の成虫と元のケルカリア集団（グループAの132匹のケルカリア）との区別を試験した。 また、方法Iの344匹とB群の122匹のケラレとの鑑別試験を行った。さらに、方法Iの31匹のマウス間の成虫と方法IIの22匹のマウス間の成虫のばらつきを別々に評価した。 ミラカリアについては，方法Iでは肝臓のミラカリア93匹と便のミラカリア124匹について，方法IIでは肝臓と便の両方のミラカリア88匹について同様に遺伝的差異を検定した。
niMLGを持つサーカリアのシングルトンのキンシップ解析
各カナムシからのサーカの遺伝子型の数をカウントした。 タイピングエラーや胞子嚢増殖時の体細胞変異と本来のmiracidium遺伝子型を区別することは困難であるため、不一致の対立遺伝子が2個以下のセルカリア遺伝子型群をniMLGとし、各巻貝の同一miracidium由来の系統に帰属させた。 最後に、Rパッケージallelematch ver.を用いて、各カタツムリにおいて遺伝的クローンを確立したmiracidiaの数を系統番号に基づき評価した。 2.5 .
あるカタツムリのniMLGを持つセルカリアは1つのmiracidiumに由来すると推定されるので、niMLGの遺伝子型の1つ（singleton）をallematchの関数amClusterでmiracidiumに由来するセルカリア群を表すように割り当て、miracidia間の近縁分析用にフィルターしたデータセットを作成する。 次に、SPAGeDi ver.のStreiffによる対立遺伝子サイズ相関係数（I′）を用いて、シングルトン（miracidia）間のキンシップを推定した。 1.5a を用いてカタツムリ内およびカタツムリ間レベルで推定し、1 つのカタツムリにおけるミラクルムシの凝集がミラクルムシの遺伝的類似性と相関しているか否かを検討した。
異なる数のカタツムリから得たcercariaサブセットの対立遺伝子分布
カタツムリ間のcercariaeの不均一な遺伝的分布は、カタツムリホストのサンプルサイズがcercaria suprapopulation（すべてのカタツムリのcercariae）の対立遺伝子分布に影響するであろうことを示唆した。 さらに、集団の遺伝子量を示す基本指標であるNaを、異なる数のカタツムリを無作為に選択し、異なるセルカリアサブセットにおいて各遺伝子座について評価した。 カタツムリは、Rの基底関数sampleを用いて、各群で1から最大まで設定した所与の数でランダムに選択し、100回の反復を行った。 各複製下で、各カタツムリのcercariaeの数は、実用的な実現可能性と本研究で各カタツムリで遺伝子型を決定した平均数に従って決定した5個とした。 同数の巻貝の遺伝子型をマージし、Rパッケージ hierfstat の関数 nb.alleles を用いて各遺伝子座の Na を推定した。 遺伝的多様性とカタツムリ数の相対性は、全Naの50%と95%を設定したときの最小サンプルサイズを算出することで評価した。
雌雄成虫間の遺伝的距離
交配時のS. japonicumの遺伝的選好の可能性を検出するため、マウス個体の各対における雄雌間の遺伝距離DswはPopulations ver.で測定された。 1.3.32（http://www.bioinformatics.org/~tryphon/populations/）で測定し、同じ宿主のペアのメスとペアのない虫（ある場合、ペアのない虫はほとんどがオス）の間の距離と比較した。
ミラシディアの父性識別
各マウスのすべての成虫とミラシディアの対立遺伝子頻度は、Cervus 3.0 の Allele Frequency Analysis 機能で解析・計算された。 最終的に9つの遺伝子座すべてが、複合非排他確率が0.01%未満で、さらなる親子鑑定に適したマーカーと評価された。 対立遺伝子頻度に基づいて親子関係解析のシミュレーション機能を適用し、共優性遺伝子座の解決力と対数尤度（LOD）の臨界値を以下の仮定で推定した。 マウス1匹につき10,000匹の子孫（miracidia）、マウス1匹につき10匹の母親と父親の候補（宿主で採取した成虫の数に応じた推定サンプル数）、候補の割合は遺伝子型別成虫の100％とし、その他のオプションはデフォルトで設定した。 最後に、Parentage AnalysisモジュールでAlle Frequency AnalysisとSimulation of Parentage Analysisの両方の出力を参照し、各子孫を最も可能性の高い親に割り当てた。 子孫と2つ以上の対立遺伝子が不一致の親は除外し、LODが最大のものを親として最も可能性が高いとした。
統計解析
本研究の統計解析に用いたデータは全て連続データである。 遺伝子座の遺伝的多様性指標（Na、Ae、Ar、Hs）、近親係数（I′）、個体間遺伝距離（Dsw）について2群間の差の有意性を0.05の有意水準で評価した。 まず、Sharpiro-Wilk検定により、データセットの正規分布を確認した。 データセットが正規分布を満たしている場合は、ペアサンプル/独立t-検定を適用した。 それ以外の場合は、関連/独立標本に対してWilcoxon signed-rank testとMann-Whitney U-testが適用された。 多重比較におけるP値の補正には、Bonferroni補正を用いた
。