Deuterated Chloroform
13.4.4 Ocena i utrzymanie wydajności przyrządu
Włączenie przyrządów laboratoryjnych do systemów zarządzania jakością używanych do certyfikacji laboratoriów (np. ISO17025 dla laboratoriów analitycznych) wymaga oceny i utrzymania wydajności przyrządu w regularnych odstępach czasu. Certyfikaty te pozwalają analitykom laboratoryjnym na tworzenie testów kwalifikacji operacyjnej (OQ) i kwalifikacji wydajności (PQ) w zależności od przeznaczenia aparatu. Tak więc, w przypadku NMR testy OQ/PQ mogą się różnić w zależności od typowych testów analitycznych wykonywanych na urządzeniu. Nowoczesne aparaty posiadają automatyczne procedury, które wymagają od użytkownika wprowadzenia odpowiedniej próbki, następnie seria testów jest wykonywana w sposób zautomatyzowany. Na koniec tych testów wydawany jest raport, który pozwala użytkownikowi ocenić ogólną wydajność spektrometru.
Dla testowania terapii białkowych w roztworach wodnych te testy OQ powinny obejmować: kalibrację temperatury, kształt linii na sygnale acetonu w deuterowanym chloroformie, czułość na sygnałach etylobenzenu w deuterowanym chloroformie i/lub tłumienie wody z oceną czułości na anomerycznych protonach 2 mM roztworu sacharozy. Kalibracja temperatury jest ważna, ponieważ na dynamikę białka mają wpływ warunki panujące w roztworze, co może mieć duży wpływ na obserwowane szerokości i częstotliwości sygnału. Regulacja temperatury próbki w spektrometrach NMR polega na dokładnej kontroli temperatury powietrza sondy i szybkości jego przepływu. Wpływ powietrza sondy na temperaturę próbki może być mierzony poprzez pomiar przesunięć chemicznych 100% roztworu metanolu lub 100% roztworu glikolu etylenowego. Przesunięcia te zostały dokładnie zmierzone, tak aby można było ocenić rzeczywistą temperaturę próbki przy danym ustawieniu temperatury powietrza sondy i natężenia przepływu.
Wpływ posiadania dobrej podkładki pod próbkę (tj. jednorodnego pola magnetycznego w całej obserwowanej części próbki) na jakość widma jest nie do przecenienia: im węższe piki, tym lepsza rozdzielczość i czułość mierzonych sygnałów. W szczególności, jeśli stosowane są techniki tłumienia sygnału, im węższa podstawa piku, który ma być tłumiony, tym lepiej będą działać techniki presaturacji lub selektywnego tłumienia sygnału w wąskim paśmie. Na szczęście, pojawienie się technik mapowania pola i gradientowych podkładek regulacyjnych uprościło to często czasochłonne zadanie regulacji ustawień podkładek regulacyjnych dla każdej próbki. Jednakże, będą próbki, dla których mapy podkładek nie będą działać dobrze, a czas będzie musiał być poświęcony na dostosowanie podkładek, aby uzyskać optymalną odpowiedź instrumentu.
Ocena czułości spektrometru z próbkami standardowymi jest idealnym sposobem śledzenia wydajności systemu, a wartości uzyskane z testów standardowych muszą spełniać lub przekraczać specyfikacje spektrometru określone przez producenta. Należy zauważyć, że specyfikacje spektrometru są często ustalane w sposób konserwatywny przez producenta, aby zapewnić, że jego urządzenie przejdzie te testy podczas instalacji. Jednakże, przeprowadzanie testów OQ/PQ w regularnych odstępach czasu pozwala właścicielowi spektrometru zapoznać się z możliwościami jego konkretnego urządzenia. Odchylenia od zestawu wartości ustalonych przez rutynowe testy powinny być dokładnie zbadane, ponieważ mogą wskazywać na nieprawidłowe działanie przyrządu.
W przypadku analizy małych cząsteczek w rozpuszczalnikach organicznych, wykorzystanie sygnału acetonu w deuterowanym chloroformie w celu uzyskania nie tylko kształtu linii Lorentziana i wąskiego FWHH, ale także wąskiej podstawy (np. <20 Hz przy 20% sygnału satelitarnego 13C) zwykle prowadzi do najlepszej czułości na sygnały etylobenzenu w deuterowanym chloroformie. Dla spektrometrów używanych do otrzymywania widm w roztworach wodnych, drugi pomiar czułości jest ważniejszy: zdolność spektrometru do uzyskania dobrej czułości i rozdzielczości z sygnałów w pobliżu piku wody. Tak więc pomiar czułości z anomerycznymi sygnałami protonowymi ze standardu składającego się z 2 mM sacharozy w 95% H2O/5% D2O roztworze z zastosowanym tłumieniem wody jest bardziej realistyczną miarą wydajności sygnału do szumu spektrometru dla NMR próbek terapeutycznych białek.
Dla PQ na spektrometrze oceniającym jakość terapii białkowych, krytycznym atrybutem jakości tych leków jest specyficzna struktura trzeciorzędowa nadana przez składanie łańcucha aminokwasów. Dlatego, jako PQ na spektrometrze wykonującym analizę map strukturalnych 2D, widma 2D-HSQC mogą być wykonane w krótkim czasie na próbce wzbogaconej izotopowo 15N lub 13C w celu ustalenia zdolności spektrometru do wykonywania programów impulsowych z efektywnymi schematami odsprzęgania i wyboru koherencji gradientu. 13C lub 15N izotopowo wzbogacone białko (np. białko z domeną SH3 lub ubikwityna) roztwory standardowe w szczelnych probówkach są dostępne w handlu w stężeniach, które pozwalają na zebranie danych w ciągu kilku godzin. Odpowiednio skalibrowane spektrometry o częstotliwości 500 MHz i wyższej oraz wyposażone w sondę kriogeniczną mogą mierzyć mapy struktury 2D białek występujących w naturalnej obfitości (tj. niewzbogaconych izotopowo) w stężeniu ∼1,0 mM w ciągu 2-3 dni pracy spektrometru .